脑脊液细胞计数与实时荧光定量PCR检测结核菌在结核性脑膜炎诊断中的相关性分析

吕翠环，李玉静，郑立恒，刘俊平，杜月菊，马玉腾

(1.河北省胸科医院检验科，河北 石家庄 050041；

2.河北省胸科医院呼吸科，河北 石家庄 050041；

3.河北医科大学第二医院急诊重症医学科,河北 石家庄 050000)

·论著·

脑脊液细胞计数与实时荧光定量PCR检测结核菌在结核性脑膜炎诊断中的相关性分析

吕翠环1，李玉静1，郑立恒1，刘俊平2，杜月菊1，马玉腾3

(1.河北省胸科医院检验科，河北 石家庄 050041；

2.河北省胸科医院呼吸科，河北 石家庄 050041；

3.河北医科大学第二医院急诊重症医学科,河北 石家庄 050000)

[摘要]目的分析结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)脑脊液细胞数变化,探讨其与脑脊液中结核分枝杆菌实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)检测阳性的相关性。方法选取确诊的结核性脑膜炎患者81例，应用全自动血液-体液细胞分析仪进行脑脊液细胞总数计数、离心甩片作脑脊液细胞涂片,光学显微镜图像分析系统分类计数，应用FQ-PCR法检测脑脊液中结核分枝杆菌,两者进行相关性分析。结果FQ-PCR法检测TB-DNA阳性率为50.6%(41/81)，其中FQ-PCR阳性组中白细胞总数高于阴性组(P<0.05)。且白细胞数与FQ-PCR拷贝数呈正相关。FQ-PCR阳性中脑脊液细胞学表现：以混合型细胞反应为主，其中淋巴细胞比例0.590，中性粒细胞比例0.366。结论结核性脑膜炎脑脊液细胞学大多以淋巴细胞反应为主，脑脊液白细胞数的变化可以反映疾病的严重程度，与FQ-PCR联合检测对早期诊断结核性脑膜炎有一定的意义。

[关键词]结核,脑膜；白细胞增多；实时聚合酶链反应

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.04.019

结核性脑膜炎是结核病中最严重的类型，其临床表现复杂、多样，病情进展迅速，致死率、致残率高。其死亡与延迟诊断和治疗密切相关，所以迫切需要早期快速诊断。目前对结核性脑膜炎的诊断及辅助诊断方法众多，以脑脊液结核菌涂片镜检最为广泛，为了提高患者的存活率，如何选择快速方法，克服传统细菌学的局限性是关键。本研究对81例结核性脑膜炎患者的脑脊液标本进行实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)及细胞学结果的回顾性分析，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料2012年12月—2014年5月在河北省胸科医院临床确诊为结核性脑膜炎患者81例，男性47例，女性34例，年龄14~68岁,平均(32.1±12.3)岁。所有患者均出现不同程度的发热、头痛、呕吐症状，脑膜刺激征阳性，其中28例为血性播散性肺结核。

1.2诊断标准所有对象经过临床诊断、实验室诊断、影像学诊断、临床治疗评价等，根据中华医学会编著的《临床诊疗指南结核病学分册》标准[1]确诊。

1.3检测方法

1.3.1脑脊液常规检查①收集常规腰椎穿刺脑脊液1.0~1.5 mL，先观察颜色、透明度，应用Sysmex XT-4000i分析仪测白细胞总数；②取剩余脑脊液于Thermo Cytospin 4离心机进行离心甩片5 min，取出玻片晾干后行瑞姬染色，应用光学显微镜图像分析系统分类计数。

1.3.2FQ-PCR检测收取无菌留取的脑脊液1 mL进行脑脊液TB-DNA检测，仪器设备为达安基因有限公司生产的7600型实时荧光定量检测系统，试剂盒为中山大学达安基因有限公司生产的结核分枝杆菌核酸扩增荧光试剂盒。严格按照试剂说明书操作，每次操作均加入质控品。

2结果

2.1FQ-PCR结果所有标本中均选第1次脑脊液测定TB-DNA>50 copy为阳性。81例患者中FQ-PCR方法检测TB-DNA阳性者41例，均值为13.94×102，阴性者40例，均值为31.25。

2.2脑脊液常规结果81例标本中均选第1次脑脊液测定白细胞总数>8×106/L为阳性；其中TB-DNA阳性组中白细胞总数(1~600)×106/L，平均(202.87±174.6)×106/L，阴性组中白细胞总数(2~521)×106/L，平均(130.25±145.6)×106/L，两组间差异有统计学意义(t=2.053,P<0.05),见图1。

脑脊液细胞学分类主要是以混合细胞反应为主，其中淋巴细胞0.590，中性粒细胞0.366。

图1　FQ-PCR阳性组与阴性组白细胞总数比较Figure 1　Comparison of leukocyte number between PCR positive group and PCR negative group

2.3脑脊液FQ-PCR阳性与其对应白细胞总数相关性分析脑脊液FQ-PCR阳性数值与其对应的白细胞总数呈正相关(r=0.937，P<0.01)，见图2。

图2　脑脊液FQ-PCR阳性与白细胞总数的关系Figure 2　Correlation between FQ-PCR positive cerebrospinal fluid and leukocyte number

3讨论

结核性脑膜炎是结核分枝杆菌引起的以脑膜为主的非化脓性炎症,是最严重的肺外结核病,由于其不易从脑脊液涂片中找到结核杆菌,细菌培养和动物接种的周期较长，加之临床表现没有特异性，使得其早期诊断变得非常困难，但是结核性脑膜炎的早期诊断和治疗可以挽救患者生命和降低其神经功能的损伤，所以要求找到敏感和特异的快速诊断结核性脑膜炎的方法，结核性脑膜炎患者的早期临床诊断一直是临床工作中的一项难题。

应用细胞学动态观察对结核性脑膜炎进行早期诊断是目前临床诊断中操作简单实用的一种方法。本研究选取81例结核性脑膜炎患者检测脑脊液细胞发现患者早期反应主要是以混合细胞反应为主，其中淋巴细胞0.590，中性粒细胞0.366，结果证明结核性脑膜炎细胞学有2种类型，不仅具有结核性脑膜炎早期渗出常见的混合细胞型反应类型[2]，同时还有少量结核性脑膜炎呈淋巴样细胞反应类型。这与闫世明等[3]的研究一致。本研究中结核性脑膜炎患者脑脊液白细胞总数最高为600×106/L，Kawakami等[4]也报道结核性脑膜炎脑脊液中白细胞数高达870×106/L，且大多为中性粒细胞。

PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断，理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。PCR成为一种潜在的理想的检测结核性脑膜炎的工具[5]。一般实验室能检出10~100基因拷贝，而目前病原体抗原检测方法一般需要105~7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。定量PCR研究资料已表明，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有关系[6]。FQ-PCR方法检测TB-DNA可进行准确的定量检测，特异度更高，操作简单快速。二者方法各有特点。有报道基因探针方法检测结核性脑膜炎TB-DNA敏感度33%~83%，特异度100%[7],而FQ-PCR法检测脑脊液结核杆菌具有更高的敏感度与特异度[8-9]。本研究结果显示，81例确诊结核性脑膜炎标本中41例TB-DNA结果阳性基本与报道相符。根据PCR检测原理，结核菌数量与PCR的拷贝值呈正相关，但是很少文献研究PCR阳性与白细胞的相关性。本研究中TB-DNA阳性组中白细胞总数(1~600)×106/L，平均(202.87±174.6)×106/L，阴性组中白细胞总数(2~521)×106/L，平均(130.25±145.6)×106/L，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，二者呈正相关性，说明脑脊液中白细胞数与疾病的严重程度有关，这为今后临床早期诊断检测提供了依据。PCR是临床可靠的早期诊断结核性脑膜炎的方法之一[10],脑脊液TB-DNA阴性说明结核菌含量相对少量、感染程度较轻,也可能是因为临床用药使脑脊液中结核菌受到控制。本研究结果显示，FQ-PCR阳性的细胞数与FQ-PCR阴性的细胞数差异有统计学意义，说明结核性脑膜炎患者体内结核菌数量越多引起的机体免疫、应激反应越强烈[11]，最终以白细胞增多的形式表现出来。

综上所述，结核性脑膜炎脑脊液FQ-PCR阳性的细胞数显著高于FQ-PCR阴性的细胞数，且FQ-PCR阳性值与脑脊液细胞数呈正相关，细胞类型多为淋巴细胞为主的混合细胞反应。脑脊液细胞检测的敏感度与FQ-PCR检测的特异度相结合势必会为临床结核性脑膜炎的早期诊断带来希望，这需要我们进一步的探索和研究。

[参考文献]

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[4]Kawakami S,Kawamura Y,Nishiyama K，et al.Case of Mycobacterium tuberculosis meningitis:gram staining as a useful initial diagnostic clue for tuberculous meningitis[J].J Infect Chemother,2012,18(6):931-936.

[5]崔会娟,何俊瑛.脑脊液检测诊断结核性脑膜炎[J].河北医科大学学报,2006,27(5):498-500.

[6]高斌,刘敬忠.实时荧光定量PCR技术的研究及其应用进展[J].诊断学理论与实践，2005,4(6):507-509.

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[11]张敏，常晓琳，杨毅宁，等.结核性脑膜脑炎脑脊液细胞学动态分析及其诊断价值[J].中华神经外科疾病研究杂志,2009,8(3)：239-242.

(本文编辑：赵丽洁)

[收稿日期]2014-10-15；[修回日期]2014-12-09

[基金项目]河北省科学技术研究与发展计划项目(13277794D)；

[作者简介]吕翠环(1966-)，女，河北石家庄人，河北省胸科医院主任技师，医学学士，从事临床检验学研究。

[中图分类号]R529.3

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2015)04-0433-04

Correlation analysis between cell count of cerebrospinal fluid and real time PCR detection in diagnosis of cerebral tuberculosis

LV Cui-huan1，LI Yu-jing1，ZHENG Li-heng1，LIU Jun-ping2，DU Yue-ju1，MA Yu-teng3

(1.Clinical Laboratory,the Chest Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050041,China;2.Department of

Respiratory Medicine,the Chest Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050041,China;3.Intensive

Care Unit,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China)

[Abstract]ObjectiveTo analyze the cell count of cerebrospinal fluid in tuberculous meningitis(TBM) and explore the association of test positive for Mycobacterium tuberculosis by real time fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR) and cell count.MethodsThe study selected 81 patients with tuberculous meningitis.Cerebrospinal fluid cell was counted by automatic blood-body fluid cytoanalyzer,cell smears of cerebrospinal fluid were made by centrifugal machine and cells were classified by image analysis system of optical microscope.Mycobacterium tuberculosis in cerebrospinal fluid was detected by FQ-PCR and its correlation with cell count was analyzed.ResultsThe positive rate of M.tuberculosis DNA(TB-DNA) by FQ-PCR method was 50.6%(41/81).The leukocyte count of FQ-PCR positive group was higher than that of the negative group(P<0.05).The leukocyte number was positively correlated with the copy number of FQ-PCR.The characteristics of cerebrospinal fluid cytology in FQ-PCR positive group indicated that the mixed cellular reaction was dominant，and the lymphocytes ratio was 0.590,while neutrophils ratio was 0.366.ConclusionThe cerebrospinal fluid cytology of tuberculous meningitis is mostly lymphocyte reaction,cerebrospinal fluid leukocyte count in combination with PCR can reflect the severity of disease and has certain significance for the early diagnosis of tuberculous meningitis.

[Key words]tuberculosis,meningeal；leukocytosis；real-time polymerase chain reaction

河北省科学技术研究与发展指导计划项目(132777269)