MMP-9/TIMP-1在自发性高血压大鼠左室重构中的表达及血脂康胶囊的调控作用

MMP-9/TIMP-1在自发性高血压大鼠左室重构中的表达及血脂康胶囊的调控作用

朱桂平王卓1林忠伟

(广东药学院附属第一医院心内科，广东广州510080)

摘要〔〕目的探讨自发性高血压大鼠(SHR)左室重构中循环和心肌金属基质蛋白酶(MMP)-9/组织金属基质蛋白酶抑制因子(TIMP)-1的表达和血脂康干预的效果。方法30只8周龄雄性SHR随机分为低剂量血脂康组(A组)、高剂量血脂康组(B组)和对照组(C组)，每组10只。另设Wistar大鼠作为正常组(W组，n=8)。A组和B组分别每日以血脂康20 mg/kg和200 mg/kg生理盐水溶解后灌胃；连续8 w。超声心动图测定室间隔舒张期厚度(IVSd)和左心室后壁舒张期厚度(LVPWd)；取静脉血离心后取血清，ELISA法测定一氧化氮(NO)、MMP-9、 TIMP-1浓度，麻醉处死后取左心室，称重测左室重量指数(LVWI)，苏木精-伊红(H-E)染色，观察心肌细胞直径和心肌细胞面积；Van-Gieson染色检测心肌间质胶原纤维表达；免疫组化检测心肌细胞MMP-9、TIMP-1的蛋白表达。结果SHR血清NO水平明显下降，MMP-9、TIMP-1水平、LVWI、IVSd和LVPWd均明显升高，与W组比较，差异显著(P<0.05)；血脂康治疗后NO水平有所升高，MMP-9 、LVWI水平有所下降，B组与C组比较差异显著(P<0.05)；但TIMP-1、IVSd和LVPWd水平变化不大(P>0.05)。心肌细胞间胶原纤维经Van-Gieson染色显示C组中大鼠心肌细胞间胶原成分显著增多；血脂康治疗后，A、B组胶原均有所减少，B组胶原纤维数量分布零散，稀少，与正常大鼠W组相近；免疫组化染色显示心肌组织MMP-9蛋白水平在C组表达明显，与W组比较，差异显著(P<0.05)；而A、B组MMP-9蛋白表达水平较C组有所下降，B组下降最明显(P<0.05)；心肌组织TIMP-1蛋白表达水平在SHR组升高，与W组比较差异显著(P<0.05)。结论高血压左室重构出现循环和心肌MMP-9/TIMP-1表达升高，血脂康早期干预可下调MMP-9水平，改善心肌重构。

关键词〔〕心肌肥厚；血脂康；自发性高血压大鼠，基质金属蛋白酶

中图分类号〔〕R544.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：广东省中医药管理局课题(2010198)

1中山大学附属第一医院病理科

第一作者：朱桂平(1968-)，女，副主任医师，主要从事高血压及冠心病的临床及介入研究。

左室重构与左室肥厚密切相关，与心肌细胞的肥大、细胞外基质胶原蛋白改变均有关。金属基质蛋白酶(MMP)-9是降解细胞外基质成分的最主要蛋白水解系统之一，组织金属基质蛋白酶抑制因子(TIMP)-1可内源性特异性抑制MMP-9的功能，两者的相互作用在心室重构中起重要作用。他汀类药物的作用机制主要与其改善内皮功能、抗炎等有关。对内皮功能的改善同样得到不少临床和基础实验证实。内皮功能紊乱是高血压发生发展的重要因素之一，改善内皮功能可影响高血压心肌肥厚、左室重构的进程〔1〕。血脂康胶囊为红曲源性天然他汀——洛伐他汀，我们在既往研究中已证实其可改善高血压大鼠的内皮功能〔2〕，但是否能改善左室重构情况以及在此过程中心肌MMP-9/TIMP-1的表达情况尚不明确，值得进一步探索。

1材料与方法

1.1实验动物与分组8周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)30只和8周龄雄性Wistar大鼠(W组)8只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。将SHR随机分为低剂量血脂康组(A组)、高剂量血脂康组(B组)和安慰剂组(C组)，每组10只。血脂康胶囊由北大维信公司提供。A组每日使用血脂康20 mg/kg生理盐水溶解灌胃；B组每日使用血脂康200 mg/kg生理盐水溶解灌胃；C组和W组在同一时间进行同等量生理盐水灌胃。每周测大鼠体质量，随体质量增加调整给药量，连续8 w。实验前后分别使用安徽正华生物设备有限公司生产的ZH-HX-Z型无创尾动脉血压测量系统经尾动脉测血压。

1.2实验室检查治疗8 w后，经静脉采血，4℃ 3 000 r/min离心15 min，取血清-20℃冰箱保存待测。采用ELISA方法按试剂盒说明测定各组一氧化氮(NO)浓度及血清MMP-9、TIMP-1水平，NO ELISA试剂盒购自北京鑫方程生物技术有限公司；MMP-9 ELISA试剂盒由欣博盛生物科技有限公司提供；TIMP-1 ELISA试剂盒由R&D公司提供。

1.3组织学检查采血后，取出心脏，沿房室沟剪掉两心房及主、肺动脉，紧贴室间隔右侧剪除右心室游离壁，剩余部分即为左室(包括室间隔)，滤纸吸干水分，称质量，计算左心室重量指数(LVWI)=左心室质量(LVW，mg)/体质量(BW，g)。取下左心室经甲醛固定液中固定、切片，经苏木精-伊红染色观察心肌细胞和间质的改变，Van-Gieson染色检测心肌间质胶原纤维表达，采用IPP6.0专业图片分析软件分析胶原容积分数(CVF)。

1.4免疫组化染色4组心肌组织切片依序取3张分别行MMP-9、TIMP-1免疫组化染色，严格按说明书操作。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，每张切片随机取3个高倍视野进行观察，选取阳性区域测定灰度值并取平均值，同一组织的3张切片再次取平均值。所用试剂：一抗：MMP-9 抗体 (A-AJ1503b，ABGENT，San Diego，CA)，TIMP-1抗体(A-AO1052a，ABGENT，San Diego，CA)；二抗购于Dako公司。

2结果

2.1各实验组一般资料及NO、MMP-9、TIMP-1水平比较治疗前、后各组体重无明显差异(P>0.05)；8周龄SHR血压已呈现升高的趋势，16周龄SHR血压持续升高，与同周龄W组比较，差异显著(P<0.05)；16周龄SHR血清NO水平明显下降，与W组比较显著(P<0.05)；血脂康治疗后NO水平有所升高，B组与C组比较差异显著(P<0.05)；16周龄SHR血清MMP-9、TIMP-1水平均明显升高，与W组比较，差异显著(P<0.05)。血脂康治疗后，MMP-9水平有所下降，B组与C组比较差异显著(P<0.05)；但TIMP-1水平变化不大，A、B、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2各实验组间左室肥厚指标及心肌细胞间胶原纤维变化与W组比较，16周龄SHR组 LVWI明显增加(均P<0.05)；与C组比较，B组LVWI降低 (P<0.01)，而A组LVWI虽有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。与W组比较，C组室内隔舒张期存度(IVSd)和左心室后壁舒张期存度(LVPWd)增加(P<0.05)；与C组比较，A组和B组IVSd和LVPWd均有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；心肌细胞直径和心肌细胞面积B组较C组均有下降((P<0.05)，见表2。

Van-Gieson染色后可见心肌细胞染色呈黄色，细胞外间质胶原纤维呈红色；对照组C组中大鼠心肌细胞间胶原成分显著增多。与C组比较，A、B组胶原均有所减少，B组胶原纤维数量分布零散、稀少，与正常大鼠W组相近。CVF定量分析可见，A组和C组CVF明显高于W组(P<0.05)，而B组与W组比较CVF无统计学差异，见图1。

2.3MMP-9、TIMP-1免疫组化染色C组心肌组织MMP-9蛋白表达明显，与W组比较差异显著(P<0.05)；而A、B组与C组比较，MMP-9蛋白表达水平有所下降，尤以B组下降最明显(P<0.05)。A、B、C组心肌组织TIMP-1蛋白表达呈阳性，与W组比较差异显著(P<0.05)；而A、B、C三组间差异无统计学意义(P>0.05)，见图2，图3。

表1　4组大鼠收缩压及血清NO、MMP-9、TIMP-1水平的变化

与W组比较：1)P<0.05；与C组比较：2)P<0.05

图1　Van-Gieson染色结果(×200)

组别nLVWI(mg/g)IVSd(mm)LVPWd(mm)心肌细胞直径(μm)心肌细胞面积(μm2)A组102.74±0.261)1.08±0.101.30±0.0927.01±6.101)462.75±35.481)B组102.61±0.121)2)1.06±0.121.28±0.1326.12±4.291)2)442.20±23.591)2)C组102.98±0.261)1.19±0.171)1.45±0.261)31.07±4.861)479.32±40.711)W组82.17±0.320.96±0.121.19±0.1821.12±3.60408.07±22.19

与W组比较:1)P<0.05；与C组比较:2)P<0.05

图2　心肌MMP-9表达比较(×200)

图3　心肌TIMP-1表达比较(×200)

3讨论

高血压左心室重构的病理特征主要包括心肌细胞肥大、心脏成纤维细胞增殖及细胞外基质(ECM)沉积，导致心肌结构和功能重塑。ECM的合成与降解是高血压心血管重塑的重要特征。与基质代谢密切相关的酶如MMPs及其特异抑制剂TIMP在高血压左室重构中起着十分重要的作用。在正常的心脏组织，大部分的MMPs表达处于低水平，并与其抑制物TIMP共同形成随时间变化的动态平衡，维持ECM的稳定。MMPs可以介导许多物质的活化〔3，4〕，如TNF-α、TGFβ及IL-1β，这些物质一方面增加新胶原的合成，破坏心肌细胞；另一方面，可以促使MMPs表达增加，构成恶性循环，进一步加重心室重构的过程。对高血压患者和自发性高血压大鼠心脏衰竭模型的研究发现心脏中MMPs活性升高，循环血液中血清MMPs也升高，主要是MMP-9升高〔5，6〕。对高血压患者的临床观察还发现，心肌肥厚组的室间隔及左室后壁矫正的声学强度高于非心肌肥厚组，背向散射积分周期变化值低于非肥厚组，而这样的心肌声学密度定量指标的变化与血清MMP-9和TIMP-1浓度存在相关性〔7〕。因此，MMP-9/TIMP-1在高血压左室重构中扮演着重要的作用。

内皮功能紊乱是高血压左室重构发生的重要始动因素，他汀对内皮的改善应同样有利于减缓左室重构的发生发展。本研究结果提示血脂康治疗后其内皮功能改善的同时心肌肥厚的指标相应地有一定程度的改善。但这个改变过程和参与心室重构的MMP-9/TIMI-1的关系尚不清楚。Tarin等〔8〕对心肌缺血损伤的动物实验研究发现，一氧化氮诱导合酶(iNOS)缺失的小鼠或普通小鼠经抗iNOS后，缺血再灌注损伤程度更明显，主要与这两类小鼠体内ECM金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)及MMP明显增加有关。对iNOS缺失小鼠使用抗EMMPRIN中和抗体进行治疗，可在一定程度上减低缺血再灌注损伤引起的MMP-9表达，并能减低心脏受损的程度，表明NO介导的心脏保护主要是通过对EMMPRIN进行调节而起作用的，EMMPRIN可能是NO的下游因子，提示NO和MMP之间可能存在某种调控关系。王士凯等〔9〕研究发现心肌梗死(AMI)大鼠经氟伐他汀灌胃干预后与对照组相比，左室舒张末内径、LVMI均降低，心脏组织MMP-9、MMP-10表达明显降低，左室射血分数显著增加。瑞舒伐他汀对未行经皮冠状动脉介入术的AMI患者强化治疗后同样伴随着血清MMP-9水平明显下降〔10〕。本文结果也提示高剂量血脂康对循环中MMP-9水平和心肌细胞MMP-9蛋白表达均有明显抑制作用，其跟其他他汀类药物一样具有抑制MMPs的作用〔11〕，但对TIMP-1水平影响不大，不排除与干预疗程时间有关，抑或是其他机制共同参与的综合表现。

另外，老年大鼠的心脏胶原纤维比例均较青年大鼠显著增加，提示胶原沉积和胶原重塑也是心肌重构及心脏衰老的一个表现，本研究通过V-G染色显示高血压大鼠较正常大鼠心肌间质的胶原成分明显增多，高剂量血脂康干预对心肌间质胶原蛋白生成具有抑制作用，说明血脂康与其他他汀类药物一样，可改善心肌间质胶原重塑〔12～14〕。但其心肌间质的变化与MMP-9/TIMI-1的关联程度、MMP-9/TIMP-1的变化是伴随现象还是因果关系尚不明确，尚需要更多体内和体外的基础研究进一步探索血脂康胶囊对MMP-9和TIMP-1的上游调控的信号通路。

4参考文献

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〔2014-10-17修回〕

(编辑李相军)