观察体外受精中卵泡液的抗氧化能力及其对卵母细胞质量和胚胎发育的影响

梁琳，陈秀娟

（内蒙古医科大学附属医院生殖中心，呼和浩特 010050）

活性氧（ROS）是细胞有氧代谢的产物，参与细胞增殖、凋亡、损伤修复等调控。机体抵抗ROS的能力称为总抗氧化能力（TAC）。生理状态下两者保持动态平衡。TAC 在女性生殖中发挥着重要生理作用，但反映抗氧化能力的指标测定及其对卵母细胞和胚胎质量的影响结论不一。本研究以TAC、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）、巯基化合物（SH）、丙二醛（MDA）浓度作为检测蛋白氧化损伤的指标，探讨卵泡液中蛋白氧化水平及TAC 与卵母细胞成熟度、早期胚胎发育及体外受精-胚胎移植（IVFET）妊娠结局的关系。

资料和方法

一、临床资料

募集2011年3 月～5 月期间在我生殖中心行IVF-ET 不孕不育女性患者258 例，年龄24～39岁，平均年龄（31.60±4.55）岁，基础性激素水平正常，既往无吸烟史，近期未使用过其他性激素药物，未服用维生素类药物，无其他内、外科合并症。

所有患者采用黄体期降调节长方案：于前次月经周期第21～23 日注射长效醋酸曲普瑞林（辉凌，德国）1.250～1.875mg，降调时间为11～14d。于本次月经周期第3～5 日注射重组人卵泡刺激素（rFSH，默克雪兰诺，德国）进行促排卵，起始剂量为150～300 U，并根据卵泡发育情况调整药物剂量，用药时间为8～16d。当优势卵泡直径≥18mm 时肌注人绒毛膜促性腺素（HCG，珠海丽珠）5 000U，并于用药后36h于B 超引导下穿刺取卵。取卵日雌二醇（E2）值为（17 354.95±13 626.64）pmol／L；取卵日平均获卵数为（14.49±7.32）枚。

行常规IVF 162例（IVF 组），其中输卵管因素不育126例，男方少弱精子症18例，子宫内膜异位症18例；行卵胞浆内单精子注射（ICSI）96例（ICSI组），其中男方极度少精子及梗阻性无精子症72例，补救ICSI 12例，获卵数过少（新鲜周期获卵数≤3枚）行ICSI 12例。

二、研究方法

卵泡液采集及指标测定：选取卵巢内直径在18 mm 及以上的2 876个的卵泡，穿刺收集其清亮无血 液的 卵 泡 液，3 000r／min 离 心6 min 分 离 上 清液，-80℃低温冰箱内冷冻保存。采用化学发光法测定卵泡液中MDA（pmol／L）、总SH（μmol／L）、GSH-PX（U／L）和TAC（U／L）水平。检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，采用酶标微板法检测。

三、观察指标

观察卵泡液中抗氧化能力和蛋白氧化水平与患者获卵数、卵母细胞成熟率、正常受精率、卵裂率、优胚率及妊娠结局间的相关性。IVF组卵母细胞成熟率＝受精后第2 日成熟卵母细胞数／获卵总数×100%，正常受精率＝受精后第2日正常受精数／获卵数×100%；ICSI组中卵母细胞成熟率＝取卵日去除颗粒细胞后成熟卵母细胞数／获卵总数×100%，正常受精率＝受精后第2日正常受精数／成熟卵子数×100%。卵裂率＝正常卵裂胚胎数／正常受精数×100%；优胚率＝优质胚胎数／可移植胚胎数×100%。优质胚胎标准为卵裂期胚胎评分在Ⅱ级以上的胚胎［1］。

四、统计学分析

采用SPSS 10.0统计学软件包进行数据分析。计数资料采用率（%）表示，计量资料以（±s）表示，组间比较采用χ2检验或t检验，变量之间相关性研究采用相关性检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、卵泡液抗氧化能力和蛋白氧化水平与妊娠结局和胚胎发育的关系

患者平均卵母细胞成熟率为（91.58±10.96）%，正常受精率（63.42±20.12）%，卵裂率（95.34±11.81）%，优胚率（47.89±27.61）%，平均冷冻胚胎数（5.67±5.27）个。妊娠组96例，未妊娠组162例，临床妊娠率为37.2%。

在妊娠组和未妊娠组中，TAC、GSH-PX、MDA 和SH 水平的比较，均无显著性差异（P＞0.05）（表1）。

比较抗氧化指标与卵母细胞质量及胚胎发育结局：在IVF 组中TAC 活力仅与获卵数呈负相关（r＝-0.475，P＝0.012），SH 水平与优胚率呈负相关（r＝-0.385，P＝0.047）。ICSI组中TAC 活力与获卵数、受精及胚胎发育参数间无显著性相关；GSH-PX 活力与卵母细胞成熟率呈负相关（r＝-0.505，P＝0.046）；MDA 与正常受精率呈正相关（r＝0.609，P ＝0.012），与 卵 裂 率 呈 负 相 关（r＝-0.541，P＝0.030）（表2）。整体上看，MDA 水平与正常受精率呈正相关（r＝0.371，P＝0.038），与优胚率呈负相关（r＝-0.301，P＝0.050）；其他指标与受精率的相关性不显著；获卵数与TAC 活力呈现负相关（r＝0.338，P＝0.027）（表2）。

不同授精方式中取卵日雌激素水平与卵泡液的抗氧化能力和蛋白氧化水平的相关性：取卵日E2水平与抗氧化指标间并不具显著相关性（表3）。

二、不育原因与抗氧化指标间的关系

考虑到不育因素与卵母细胞质量及胚胎发育间的相关性，根据不育原因将IVF组患者分为输卵管因素组、男方少弱精子症组、子宫内膜异位症组；将ICSI组患者分为男方极少及无精子症组（男方极度少精子及梗阻性无精子症）和获卵过少组（新鲜周期获卵数≤3枚）两组。比较5组间抗氧化指标，结果显示获卵过少组MDA 水平与内膜异位症组、男方少弱精子症组、男方极少及无精子症组存在显著性差异（P＜0.05）（表4）。

因患者年龄差别可能存在不同的抗氧化指标的差异，故将患者按照年龄段分为＜31岁、31～＜37岁和≥37岁3组。观察胚胎发育情况及抗氧化指标，发现抗氧化指标在不同年龄组间无显著性差异（P＞0.05），而31～＜37岁组的卵裂率较＜31岁组显著增高（P＜0.05），其他获卵情况及优胚率在各年龄组间均无显著性差异（P＞0.05）（表5）。

讨 论

ROS的产生反映健康卵泡的代谢活性，在IVF授精后7～24h出现峰值，对胚胎分裂起着促进作用。但是其活性升高会对卵母细胞成熟和后续胚胎发育造成不利影响，包括卵母细胞减数分裂停滞或凋亡，胚胎碎片含量升高及囊胚形成率过低等，称为氧化应激损伤［2］。已有研究表明，卵泡液ROS水平和总TAC 与卵母细胞成熟和早期胚胎发育的关系密切，可导致女性不孕症的发生［3］。有学者认为抗氧化剂的消耗对妊娠结局没有预测价值，并证实TAC水平升高与不明原因不孕及多囊卵巢患者行IVF时卵子不受精有关，且各年龄段患者卵泡液中TAC含量差异不显著［4］。同时也发现卵泡液中卵子与TAC 活性无相关性，TAC 的基线水平与抗氧化剂的消耗也不相关。因此TAC 对妊娠结局的预测能力有限。Appasamy等［5］证实，TAC 和卵巢反应及其他反映妊娠结局的参数间不具显著相关性，但低水平的TAC可增加移植前胚胎的生存能力。

本研究显示，卵泡液的TAC 活性是变化的，与获卵数呈负相关，提示TAC 可能在卵母细胞发育过程中起一定作用。但是从卵巢对Gn 的反应上看，取卵日的E2水平与抗氧化指标间无相关性，也未发现TAC与妊娠结局的相关性，因此可能不宜将其作为预测妊娠结局的指标。邵丽等［6］认为抗氧化能力与卵母细胞发育呈正相关，氧化水平与卵巢对FSH 的刺激反应性呈正相关，而高氧化水平者发生卵巢过度刺激综合征（OHSS）风险增加。Pasqualotto等［7］未发现TAC 与卵母细胞成熟、受精卵分裂和胚胎质量方面的相关性，仅发现TAC 水平若按照年龄分组后与妊娠率呈正相关。而本研究在4种抗氧化指标按年龄分层分析后显示，TAC 水平在不同年龄段均无显著性差异。可能本研究中采用酶标微板法测定TAC 水平的准确性仍需要检验，更精确的检测手段需要进一步探讨。

表1 妊娠组和未妊娠组卵泡液中TAC、GSH-PX、MDA 和SH 水平的比较（±s）

表1 妊娠组和未妊娠组卵泡液中TAC、GSH-PX、MDA 和SH 水平的比较（±s）

组 别 例数 TAC（U／L） GSH-PX（U／L） MDA（pmol／L） SH（μmol／L）妊娠组 96 5.82±1.46 131.51±19.79 3.08±1.14 872.47±97.23未妊娠组 162 5.33±2.04 118.00±33.07 2.98±2.14 796.47±193.59

表2 TAC、GSH-PX活力、MDA 和SH 水平及不同授精方式与卵母细胞质量和胚胎发育结局的相关性

表3 不同授精方式中取卵日E2 水平与卵泡液的抗氧化能力和蛋白氧化水平的相关性

表4 不育原因各组间抗氧化指标的比较（±s）

表4 不育原因各组间抗氧化指标的比较（±s）

注：与内膜异位症组、少弱精子症组、极少及无精子症组比较，＊P＜0.05

组 别 例数 TAC（U／L） GSH-PX（U／L） MDA（pmol／L） SH（μmol／L）输卵管因素组（IVF） 126 6.10±4.62 122.50±30.29 2.72±0.84 829.65±189.63少弱精子症组（IVF） 18 4.62±1.60 138.71±32.17 3.06±1.26 809.97±68.54内膜异位症组（IVF） 18 4.52±1.18 140.06±22.95 3.04±0.29 885.35±52.80获卵过少组（ICSI） 24 5.39±2.38 122.18±13.63 2.16±0.41＊ 869.98±59.28极少及无精子症组（ICSI） 72 5.43±1.83 128.43±21.20 3.89±2.53 859.31±96.72

表5 不同年龄段患者胚胎情况及抗氧化指标的比较（±s）

表5 不同年龄段患者胚胎情况及抗氧化指标的比较（±s）

注：与＜31岁组比较，＊P＜0.05

组 别 例数 ICSI／IVF（n） 获卵数（个） 卵母细胞成熟率（%） 受精率（%） 卵裂率（%）＜31岁 108 48／60 17.17±7.06 91.90±10.47 62.88±19.58 91.69±15.85 31～＜37岁 102 30／72 13.71±7.68 93.17±10.02 65.90±19.07 99.63±1.52＊≥37岁 48 24／24 1.13±4.91 87.48±14.13 59.36±25.12 94.45±11.88组 别 例数 优胚率（%） 冷冻胚胎数（个） TAC（U／L） GSH-PX（U／L）MDA（pmol／L） SH（μmol／L）＜31岁 108 43.38±24.95 6.56±4.55 5.36±1.45 125.63±21.49 3.08±1.18 852.36±71.60 31～＜37岁 102 52.92±22.52 6.35±6.39 6.10±1.84 127.09±32.29 2.73±0.86 874.35±64.97≥37岁 48 47.32±42.29 2.25±2.49 5.28±1.86 127.12±2 3.52 3.60±3.00 761.74±302.44

GSH-PX 是机体清除氧自由基和ROS的主要酶类，在卵泡液中作为酶促类抗氧化物存在，成熟卵中GSH-PX 含量较高，GSH-PX 的合成可做为评价卵母细胞发育潜能的一种指标［8］，若氧化反应增强和抗氧化能力受损即会产生氧化应激。卵母细胞周围的颗粒细胞结构和功能与卵母细胞发育相关，并参与GSH-PX 合成。动物实验表明，GSH-PX 在胚胎植入前囊胚阶段的含量不到MⅡ期的10%［9］。在窦状卵泡，卵母细胞和颗粒细胞通过缝隙连接的通信对正常的卵母细胞和卵泡发育起着非常重要的作用［10］。本研究中，GSH-PX 活力在ICSI组与卵母细胞成熟率呈负相关，可能与ICSI时卵母细胞受精前去除颗粒细胞而导致GSH-PX 合成降低有关，成熟度高的卵母细胞与颗粒细胞依赖性关系会降低。但两组不同授精方式随后的胚胎发育程度与GSH-PX 含量均未见相关性。而Das 等［11］研究发现，GSH-PX 活性与妊娠率呈正相关。本研究因样本量较少，故可能影响了其与妊娠率关系的判断。

机体抗氧化系统中氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，生成活性羰基类物质MDA，影响膜蛋白和核酸的功能和代谢。目前广泛用于氧化应激水平分析的是对不饱和脂肪酸过氧化反应（LPO）标记物MDA 生成的测定，可间接反映细胞损伤的程度，因此MDA 是否对胚胎卵裂有影响值得探索。本研究观察了MDA 水平与受精率和卵裂率的关系，发现MDA 水平与正常受精率呈正相关，表明其对受精率影响有实际意义。MDA 与优胚率呈负相关，在ICSI组中与正常受精率呈正相关，与卵裂率呈负相关。IVF 组中受精率与MDA 水平无显著相关。表明过低的抗氧化能力会影响受精率和随后的胚胎发育。Kazemi等［12］用MDA 作为氧化应激标记物，发现其与优胚率呈负相关。这与本研究结果基本一致，但他们认为MDA 与受精率间的关系不显著。Celik等［13］的研究却表明卵泡液中MDA 水平与受精情况及妊娠结局无关。Velthut等［14］认为，子宫内膜异位症患者卵泡液中抗氧化能力减弱。本研究发现内膜异位症患者MDA 水平高于因男性因素行ICSI的患者，这可能因为内膜异位症患者抗氧化能力减弱而导致氧化产物生成升高。

SH 参与维持细胞内氧化还原的正常状况和蛋白巯基的功能状态，并参与代谢调节、信号转导和基因表达的调控。Bedaiwy 等［15］认为，SH 化合物会提高合子中GSH 的浓度，促进胚胎发育到囊胚阶段。Tatemoto等［16］认为卵泡液中SH 检测可反映出卵母细胞胞质成熟度，SH 过低则会影响卵母细胞发育潜能。本研究中SH 检测水平仅在IVF 组中与优胚率呈负相关，可能其与胚胎发育之间有关联。推测当卵泡液内受氧化损伤的蛋白增多会引起降解氧化蛋白的酶降低，从而影响细胞正常代谢过程，导致在受精、卵裂中起着重要作用的一些蛋白功能下降，故过高的SH 蛋白化合物也会对IVF结局起到负面作用，这与Lopes等［17］的研究相一致。

为探讨抗氧化能力和氧化产物与卵母细胞受精率及妊娠结局间的关系，本研究分析了反映抗氧化能力的4 项指标：TAC 和GSH-PX 活力及蛋白氧化产物MDA 和SH。GSH-PX 作为反映卵泡液抗氧化能力的标志物，检测其在卵泡液中的水平，可望为解决氧化损伤、改善早期胚胎质量提供依据。卵泡液中各种氧化损伤标志物与卵母细胞成熟度、胚胎的质量以及受精和妊娠的相关性结论仍然存在争议。本研究中虽然选取同一地区不孕不育患者纳入统计，但生活习惯等易引起抗氧化指标差异的因素并未予以考虑，这些因素也可能会对卵母细胞及胚胎质量等造成一定程度影响，使结果产生偏倚，故氧化应激与女性生殖的关系尚需要进一步的研究和探讨。

［1］ 庄广伦.现代辅助生育技术［M］.第1版.北京：人民卫生出版社，2005：240-241.

［2］ 姜晓媛，孙振高，连方，等.卵泡液代谢组学研究进展［J］.生殖医学杂志，2013，22：888-891.

［3］ 付志红.活性氧与女性生殖［J］.国外医学计划生育分册，2005，24：107-109.

［4］ Oyawoye OA，Abdel-Gadir A，Garner A，et al.The interaction between follicular fluid total antioxidant capacity，infertility and early reproductive outcomes during in vitro fertilization［J］.Redox Rep，2009，14：205-213.

［5］ Appasamy M，Jauniaux E，Serhal P，et al.Evaluation of the relationship between follicular fluid oxidative stress，ovarian hormones，and response to gonadotropin stimulation［J］.Fertil Steril，2008，89：912-921.

［6］ 邵丽，崔毓桂，千日成.卵母细胞及其胚胎发育潜能相关的生物标 记 物［J］.国 际 生 殖 健 康／计 划 生 育 杂 志，2014，33：379-383.

［7］ Pasqualotto EB，Lara LV，Salvador M，et al.The role of enzymatic antioxidants detected in the follicular fluid and semen of infertile couples undergoing assisted reproduction［J］.Hum Fertil，2009，12：166-171.

［8］ Celik E，Celik O，Kumbak B，et al.A comparative study on oxidative and antioxidative markers of serum and follicular fluid in GnRH agonist and antagonist cycles［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29：1175-1183.

［9］ 韩岩，尹多，张涛，等.谷胱甘肽对卵母细胞成熟及胚胎发育影响的研究进展［J］.江苏农业科学，2010，（3）：269-270.

［10］ Mori T，Amano T，Shimizu H，et al.Roles of gap junctional communication of cumulus cells in cytoplasmic maturation of porcine oocytes cultured in vitro［J］.Biol Reprod，2000，62：913-919.

［11］ Das S，Chattopadhyay R，Ghosh S，et al.Reactive oxygen species level in follicular fluid-embryo quality marker in IVF？［J］.Hum Reprod，2006，21：2403-2407.

［12］ Kazemi A，Ramezanzadeh F，Nasr-Esfahani MH，et al.Does dietary fat intake influence oocyte competence and embryo quality by inducing oxidative stress in follicular fluid？［J］.Iran J Reprod Med，2013，11：1005-1012.

［13］ Celik E，Celik O，Kumbak B，et al.A comparative study on oxidative and antioxidative markers of serum and follicular fluid in GnRH agonist and antagonist cycles［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29：1175-1183.

［14］ Velthut A，Zilmer M，Zilmer K，et al.Elevated blood plasma antioxidant status is favourable for achieving IVF／ICSI pregnancy［J／OL］.Reprod Biomed Online，2013，26：345-352.

［15］ Bedaiwy MA，Mahfouz RZ，Goldberg JM，et al.Relationship of reactive oxygen species levels in day 3culture media to the outcome of in vitro fertilization／intracytoplasmic sperm injection cycles［J］.Fertil Steril，2010，94：2037-2042.

［16］ Tatemoto H，Muto N，Sunagawa I，et al.Protection of porcine oocytes against cell damage caused by oxidative stress during in vitro maturation：role of superoxide dismutase activity in porcine follicular fluid［J］.Biol Reprod，2004，71：1150-1157.

［17］ Lopes AS，Lane M，Thompson JG.Oxygen consumption and ROS production are increased at the time of fertilization and cell cleavage in bovine zygotes［J］.Hum Reprod，2010，25：2762-2773.