三代旁系血亲婚育子代男性不育临床及细胞分子遗传学研究

刘项，季兴哲，张洲，孙建华，周梁，王磊，宋娟，石绒，邢俊平

（1.陕西省妇幼保健院生殖中心男科，西安 710003；2.西安交通大学第一附属医院泌尿外科，西安 710061）

三代以内旁系血亲是指在血缘上和自己同出于三代以内的亲属。三代旁系血亲婚育是指堂兄弟姐妹或姨表、姑表兄弟姐妹之间的婚育。三代旁系血亲之间的亲缘系数为1／8，近婚系数为1／16，若近亲结婚，他们的致病基因相遇的机会增多，后代智力低下、新生儿死亡率、先天性畸形和遗传性疾病的发病率高，比非近亲结婚遗传病的发病率高3～150倍。然而，近亲结婚对子代男性生育力的影响知晓甚少。本文对陕西省妇幼保健院生殖中心男科门诊收治的3例三代旁系血亲婚育子代的男性不育患者的临床特点、细胞和分子遗传学辅助检查进行报道，并结合文献进行讨论。

一、资料与方法

1.临床资料：病例1，男性，因“婚后8年未育”就诊。体貌外观、智力检查、全身体格检查及生殖器查体均无明显异常，无明显精索静脉曲张，无外伤手术史、泌尿生殖系感染史及有害物质接触史。父母为姨表兄妹结婚，共兄弟姐妹4人。大姐适龄婚育后自然生育1子3女，二哥自然生育1子1女。外生殖器B 超检查显示：睾丸大小、形状正常，无精索静脉曲张。依据WHO 人类精液检验与处理实验室手册（第五版）标准行精液常规检查：精液量3.6～4.0ml，pH 7.6～7.3，精子浓度39.70×106／ml～112.20×106／ml，精子活力0%～1%；精子形态检查：正常形态率2%。

病例2，男性，系病例1的胞弟。病例1就诊时询问病史发现，其“婚后3年，未避孕未育”，行多次精液检查示：精液量2.3～4.2ml，pH 7.1～7.5，精子浓度8.50×106／ml～10.30×106／ml，精子活力极低（2%～4%）；精子形态检查：正常形态率1%。外生殖器B 超检查显示：睾丸大小、形状正常，无精索静脉曲张。

病例3，男性，因“婚后3年未育”就诊。体貌外观、智力检查及全身体格检查无异常。无外伤手术史、无泌尿生殖系感染史、无有害物质接触史。父母为姑表兄妹结婚，共姐弟2人，大姐适龄结婚后自然生育。外生殖器B 超检查显示：睾丸大小、形状正常，无精索静脉曲张。行多次精液常规检查示：精液量及酸碱度正常，但梯度离心后均未见精子。行常规双侧睾丸活检仍未见精子。

2.外周血标本采集：严格按照无菌操作要求，分别采集3例患者外周静脉血4～6 ml，包括两份肝素抗凝标本（全血内含肝素100U／ml）及1份非抗凝标本，分别用于核型分析、全血DNA 提取（-20℃保存备用）及血清性激素水平测定。

3.主要试剂及仪器：胎牛血清（杭州四季青），微量全血基因组DNA 提取试剂盒（Axygen biosciences，美国），双抗体夹心酶联免疫试剂盒（罗氏，瑞士），Biomltra梯度聚合酶链反应（PCR）仪（Sigma，美国），WD29403c 型紫外透视仪（北京六一仪器厂）。

4.实验研究：（1）血清睾酮（T）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）水平测定：严格按照罗氏诊断试剂盒说明书操作，采用双抗体夹心酶联免疫分析法分别测定血清T、FSH、LH 水平。正常参考值：T：9.71～30.53nmol／L，FSH：≤12.4 U／L，LH：≤8.6U／L。（2）细胞遗传学研究：取经肝素抗凝全血0.4～0.5ml，放置于5ml含小牛血清的培养液中混匀。恒温37℃的孵育箱培养68～72h后，常规制备染色体标本，进行G 显带，油镜下分析100个淋巴细胞。（3）Y 染色体AZF 微缺失检测：①引物设计与合成：参考国内外相关文献［1-2］选择合成15对基因和序列标记位点（STS）片段的引物（表1）。ZFX／ZFY 作为内参对照。引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。②外周血基因组DNA 提取：肝素抗凝外周血从-20℃取出放置室温复融后，严格按照DNA 提取试剂盒说明书操作，提取外周血粒细胞基因组DNA。③目的基因片段的PCR扩增：采用Biomltra梯度PCR 仪对所有外周血基因组DNA 模板进行目的基因片段PCR扩增反应。④目的基因片段的电泳检测：经PCR 扩增的目的基因片段产物行2%琼脂糖凝胶的水平恒压电泳，之后在紫外透视仪下观察目的条带并及时拍照存档。

5.睾丸穿刺及活检：行常规睾丸穿刺，穿刺针负压抽取睾丸组织，活检组织用Bouin液（北京海德）固定，常规石蜡包埋，切片（厚0.5μm），HE 染色，使用日本Olympus BX51显微镜下观察睾丸组织可见：生精小管水肿，腔内生精细胞减少，未见明显精子，睾丸组织病理学评分（Johnsen评分）7分。

二、结果

1.生育结局：病例1与病例2系胞弟，保守药物治疗后仍不能使妻子自然妊娠，因家庭经济原因，此2例患者不接受行辅助生殖助孕，至今未育。病例3常规睾丸穿刺活检未见明显精子，但考虑到Johnsen评分7 分，认为其行睾丸显微取精术的成功率较高，遂行睾丸显微取精，获得精子，与患者沟通后行卵胞浆内单精子注射（ICSI）助孕成功，现该患者妻子已妊娠近3月，常规产检无异常。

2.血清性激素水平：3 例患者血清T、LH 和FSH 水平均正常（表2）。

3.染色体核型分析结果：外周血淋巴细胞经培养后进行G 显带，分析100个淋巴细胞，结果显示3例患者的染色体核型均为46，XY（图1、图2）。

4.Y 染色体AZF 微缺失情况：结果显示3 例患者Y 染色体长臂区的AZFa、AZFb、AZFc、AZFd均无缺失（图3）。

表1 PCR 引物序列

表2 患者血清性激素水平检测结果

图1 染色体核型分析原始图像 ×1 000

图2 染色体核型分析图像 ×1 000

三、讨论

图3 Y 染色体AZF微缺失检测（电泳图）

三代旁系血亲婚育是指堂兄弟姐妹或姨表、姑表兄弟姐妹之间的婚育，是近亲结婚中较常见的一种婚配形式。随着人类文明的进步与科学的发展，人类对近亲结婚的危害已有较深入的认识，这一陋习逐渐被摈弃。但由于经济、宗教、历史文化等原因，近亲结婚在一些国家与地区仍然流行。有研究指出近来阿联酋、卡塔尔、也门地区的近亲结婚率呈上升趋势，其中也门40%的婚姻都是近亲婚姻，其中85%都是第一代的堂兄妹结婚，甚至这些近亲结婚的当事人大多有着较高的学历和良好的家庭背景，大部分在经济部门工作［3］。

众所周知，近亲结婚会增加婚配子女的隐性遗传病的发病率。遗传学研究发现，目前所知的人类常染色体隐性遗传病约1 730多种，每个人都携带有5～6个不同的隐性致病基因。在亲缘之间，常携带相同的隐性致病基因，因此近亲婚育后会增加隐性致病基因的纯合概率，增加子女隐性遗传病的发病率，且近亲婚配的危险程度与隐性遗传病的发病率呈负相关，即：常染色体隐性遗传病愈少见，非近亲婚配子女的发病率愈低，而近亲婚配的危险性愈大［4-5］。三代旁系血亲婚育子代的发病率是非近亲婚育子代的6.25倍。最近Kelmemi等［6］对突尼斯国家患有常染色体隐性遗传病的家系调查发现，其中58%的患者为近亲婚育后代。

近亲结婚对子代男性生育力的影响鲜见报道。我们对3例三代旁系血亲婚育子代的男性不育患者进行观察发现，3例患者均表现为严重的少弱精子症和无精子症，体格检查未提示睾丸发育异常，且血清性激素水平（T、FSH、LH）均在正常范围。近亲婚育会增加隐性致病基因的纯合概率，而Y 染色体AZF区基因缺失可导致精子发生阻滞及生精障碍，因此我们进一步对3例患者的外周血染色体核型及Y 染色体微缺失进行分析，结果显示3例患者的染色体核型均为46，XY，并未发现染色体数目及结构的异常，Y 染色体AZF 区均无微缺失，提示近亲婚育子代不育并不是染色体核型及Y 染色体微缺失引起，二者可能并不影响男性的生殖内分泌功能。

因此，这类患者严重少弱精子症和无精子症的原因值得进一步关注和深入研究。已有研究报道，除Y 染色体上的相关基因对精子发生、发育有影响外，还有很多常染色体上的相关基因也对其产生一定作用［7-10］。Seboun等［11］通过对3 号染色 体上的DAZLA 基因进行研究发现，该基因可能是常染色体隐性男性不育的致病基因。在生殖细胞的发育过程中，常染色体的畸变可以导致减数分裂阻断或部分阻断，使精子生成阻滞在精母细胞水平而不能继续分化成精子，继而影响生精功能；亦可能在常染色体断裂点或附近存在着精子发生相关基因的缺失或者突变，从而造成少精子症或无精子症，临床上表现为男性不育［12］。

此外，有人发现近亲婚育可能引起子代男性精子超微结构的缺陷，造成不育。Baccetti等［13］对64例近亲结婚儿子的精子超微结构进行研究发现，有17例（27%）存在精子超微结构缺陷，而在1 506例对照组中仅发现15例（＜1%）存在精子超微结构缺陷，并且近亲婚育后代的精子活力较非近亲婚育后代的低，这可能与这些患者存在遗传基础有关。Escalier等［14］研究报道了1例近亲结婚子代的精子超微结构，该患者67.5%的精子鞭毛缺失，全部精子缺少纤维鞘的中央区，并且这种纤维鞘异常尚未在其他哺乳动物中报告，只在GAPDs基因敲除的小鼠中发现有这种现象［15］。Thépot等［16］通过基因工程敲除小鼠的JunD 基因，发现敲除JunD 基因后的小鼠在生育、性激素、精子畸形及精子头部和尾部的超微结构等多方面出现异常。另外，Latini等［17］对1例近亲结婚子代的精子形态进行研究发现，在透射电镜下可见精子尾部缺失、染色质凝聚、细胞质微粒残余，认为这与近亲结婚子代易发生基因突变从而造成精子遗传障碍有关。上述研究提示我们可以在下一步实验中对该3例患者精子的超微结构进行深入研究。

综上所述，三代旁系血亲婚育增加子代的不育风险，影响子代的精子数量、活力、畸形率及精子的超微结构，这可能与父母近亲结婚增加隐性致病基因的纯和概率及基因变异等有关。

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