发育不同步且未行穿刺的大卵泡在取卵日有无卵母细胞对IVF-ET 结局的影响

王锦凤，肖露，钱卫平，周亮

（1.北京大学深圳医院生殖医学科，深圳 518036；2.汕头大学医学院病理学与病理生理学系，汕头 515041）

在体外受精／卵胞浆内单精子注射-胚胎移植（IVF／ICSI-ET）周期中，通常需要对患者进行控制性促排卵（COH）治疗，以期获得一定数量的卵母细胞进行后续的受精及ET 等，卵母细胞的质量及其成熟率对妊娠结局非常关键。因此，在辅助生殖技术（ART）中如何提高卵母细胞成熟率成为生殖医学研究领域的焦点问题之一［1-2］。有学者研究报道，卵泡直径与卵母细胞获得发育能力的程度密切相关［3-4］。而在COH 过程中，经常会出现卵泡发育不同步、卵泡大小不一的情况，有研究认为卵泡的不同步发育会直接影响胚胎发育及妊娠结局［5］，而对发育不同步的大卵泡进行穿刺抽吸，可能有利于其余卵泡同步发育继而获得更好的妊娠结局［6］。但贾学玲等［7］对促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a）长方案促排卵中发生卵泡发育不同步的患者进行分组研究发现，穿刺抽吸组和未穿刺抽吸仅调整促性腺激素（Gn）用量组两组获得的妊娠结局比较，差异并无统计学意义，且穿刺抽吸还增加了患者的精神压力和医疗费用。目前，我院生殖医学科对于卵泡发育不同步的患者采取不穿刺方案，即通过调整Gn的使用来调节卵泡发育。但未行大卵泡穿刺抽吸、仅调整Gn用量的患者中，取卵日当天可能出现大卵泡中获卵和无卵（即卵巢功能性囊肿）的两种情形。卵巢功能性囊肿是COH 过程中出现的并发症之一，其特点是垂体降调节后B 超下可见单个或多个直径＞15 mm 的圆形、边界清楚的无回声结构，穿刺后仅可见少量颗粒细胞而无卵母细胞，目前基本认为该类囊肿的发生是因为卵泡簇发育不同步所致的优势卵泡提前发育［8］。大卵泡中获卵和无卵这两种情形是否会对后续的受精及胚胎发育产生影响尚需探讨。本研究回顾性分析146 个IVF／ICSIET 周期中出现卵泡发育不同步的临床资料，比较卵泡发育不同步且未行大卵泡穿刺的患者中，取卵日大卵泡中获卵和无卵对胚胎发育潜能及临床结局的影响。

资料与方法

一、研究对象

收集2013年1月至2014年9月在北京大学深圳医院生殖医学科行IVF／ICSI-ET 治疗、卵泡发育不同步出现大卵泡的146个周期，所有患者根据基础内分泌激素水平、窦卵泡数目等指标均采用常规促排卵方案。根据取卵日大卵泡中是否获得卵母细胞分为两组：取卵日大卵泡中未获卵组（A 组，72个周期）和取卵日大卵泡中获卵组（B 组，74个周期）。卵泡发育均匀及优势卵泡日发育的卵泡总数＜4个者不纳入本研究。

二、研究方法

1.促排卵、IVF-ET：于前一月经周期第21 天左右给予GnRH-a（达菲林，博福-益普生，法国，3.75mg／瓶）1.25mg肌肉注射，根据患者年龄和双侧卵巢窦卵泡数，在月经第4～6天开始给予Gn（果纳芬，默克雪兰诺，德国，75U／支）2～6支／d。给予Gn后4～10d，连续两天行阴道B 超监测发现有1～5个卵泡直径超过其他发育同步卵泡平均直径4mm以上者，视为卵泡发育不同步［9］。对卵泡发育不同步的患者，继续使用Gn促进卵泡发育，并根据患者卵泡发育速度及血清雌二醇（E2）水平减少或增加Gn用量，并在卵泡发育中晚期适当加用人绝经期促性腺激素（HMG，珠海丽珠）治疗，至人绒毛膜促性腺激素（HCG，珠海丽珠）注射日。当至少2个或以上卵泡直径≥20mm 时，注射HCG 5 000～10 000U，34～36h后在B超引导下取卵，所获卵母细胞行后续IVF-ET 或ICSI操作。18～20h后观察受精情况，48h、72h或120h后观察胚胎情况，并根据患者年龄、助孕次数等情况，择优选取2～3枚胚胎进行移植。移植后14d 检测尿和血清HCG 水平，30～35d后行B 超检查，B 超可见孕囊及胎心搏动者为临床妊娠。

2.胚胎评级及可用胚胎标准：按照Peter卵裂期胚胎评分系统［10］结合本中心实际工作对第3 天（D3）胚胎质量进行评估，分级标准如下：Ⅰ级，卵裂球大小均匀，形状规则，透亮，碎片＜5%。Ⅱa级，卵裂球稍不均匀或形状稍不规则，无胞浆颗粒现象，碎片＜10%；Ⅱb级，卵裂球稍不均匀或形状稍不规则，胞浆有颗粒现象，碎片在10%～20%之间。Ⅲ级，卵裂球明显不均匀或形状明显不规则，胞浆有颗粒现象，碎片在20%～50%之间。Ⅳ级，卵裂球严重不均匀或形状严重不规则，胞浆有颗粒现象，碎片＞50%。D3卵裂球数目达到7～9个细胞，形态评级为Ⅰ级或Ⅱa级胚胎，或融合的胚胎，视为优质胚胎。Ⅰ、Ⅱ级胚胎一般均视为可用胚胎，按Ⅰ级、Ⅱa级、Ⅱb级顺序依次优先选择，并综合优先选择7～9细胞胚胎用于ET。Ⅲ、Ⅳ级胚胎一般不用作胚胎移植，视为不可用胚胎。

3.观察指标：女方年龄、不育年限、Gn 总量、Gn天数、基础卵泡刺激素（FSH）、基础E2、基础黄体生成素（LH）、HCG 日LH、HCG 日E2、HCG 日孕酮（P）、男方年龄、精子密度等。卵母细胞成熟率（%）＝成熟卵母细胞数／获卵数×100%；双原核（2PN）正常受精率（%）＝2PN 受精卵母细胞数／成熟卵母细胞数×100%；2PN 卵裂率（%）＝2PN 卵裂胚胎数／2PN 受精卵母细胞数×100%；优质胚胎率（%）＝2PN 优质胚胎数／2PN 卵裂胚胎数×100%；胚胎种植率（%）＝孕囊数／移植胚胎数×100%；临床妊娠率（%）＝临床妊娠数／移植周期数×100%。

三、统计学方法

采用SPSS l7.0软件进行统计分析，结果以均数±标准差（±s）或率（%）表示，率之间比较采用χ2检验，均数间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两组一般情况比较

两组女方年龄、不育年限、辅助生殖治疗方法、男方年龄、精液体积、精液密度等比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性（表1）。

二、两组患者促排卵治疗情况比较

两组患者Gn 用量及天数、基础FSH、基础LH、HCG 日LH、HCG 日E2等比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表1 两组患者一般情况比较［（±s）］

组 别 周期数 女方年龄（岁） 不育年限（年）辅助生殖治疗方法（n）例数A 组IVF例数 ICSI例数 IVF＋ICSI 72 31.21±4.41 4.28±2.56 50 18 4 B组 74 32.34±3.93 4.10±2.26 57 10 7组 别 周期数 男方年龄（岁） 精液体积（ml） 精液密度（×106／ml） 精子活动率（%）A 组 72 34.32±6.02 3.48±1.40 64.80±33.50 55.55±1 7.93 B组 74 34.01±4.88 3.13±1.24 71.16±39.92 54.21±17.93

表2 两组患者促排卵治疗情况比较［（±s）］

表2 两组患者促排卵治疗情况比较［（±s）］

组 别 周期数 Gn总量（支） Gn天数（d） 基础FSH（U／L） 基础E2（pmol／L） 基础LH（U／L）A 组 72 36.73±15.60 16.31±4.86 7.22±2.34 43.50±2 6.41 4.64±2.67 B组 74 36.40±15.89 16.89±7.03 7.88±2.90 43.39±31.22 4.82±2.27组 别 周期数 移植日子宫内膜厚度（mm） HCG 日LH（U／L） HCG 日E2（pmol／L） HCG 日P（nmol／L）A 组72 13.43±2.36 2.18±2.40 3 429±1 300 1.33±1.17 B组74 12.79±2.27 2.28±1.89 3 021±1 358 1.22±0.90

三、两组患者促排卵治疗结局比较

两组患者平均获卵数及平均移植胚胎数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；A 组卵母细胞成熟率、2PN 卵裂率明显高于B 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与B组比较，A 组的2PN 受精率、优质胚胎率、胚胎种植率、临床妊娠率有增高的趋势，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表3）。目前，获得临床妊娠的51 位患者均处于孕期，按时进行产科检查，胎儿及母体情况良好。

表3 两组患者促排卵治疗结局比较［（±s），n（%）］

表3 两组患者促排卵治疗结局比较［（±s），n（%）］

组 别 周期数 平均获卵数（个） 平均移植胚胎数（个） 卵母细胞成熟率 2PN 正常受精率A 组 72 9.32±4.82 2.13±0.43 612／671（91.21）＊ 396／612（64.71）B组 74 10.88±5.52 2.05±0.45 696／805（86.46） 434／696（62.36）组 别 周期数 2PN 卵裂率 优质胚胎率 胚胎种植率 临床妊娠率A 组 72 391／396（98.74）＊ 146／391（37.34） 35／126（27.78） 26／61（42.62）B组 74 419／434（96.54） 156／419（37.23） 33／131（25.19） 25／64（40.63）

讨 论

在自然周期中，优势卵泡分泌高浓度的抑制素和E2，同时下调FSH 水平，导致小卵泡闭锁，并以旁分泌和自分泌的形式直接对邻近卵泡的生长发育产生抑制作用［11］。而在COH 过程中，通常需要通过药物刺激促使多个卵泡同时发育，以期获得一定数量的卵母细胞行后续的IVF 及ET，所获卵母细胞的整体质量与卵泡生长发育是否同步有重要关系。早年就有学者指出，使用GnRH-a进行垂体降调节可促进卵泡发育同步，改善妊娠结局［12］。但在COH 过程中，卵泡发育不同步的情况仍时有发生［13］，促排卵药物虽然可以促使多个卵泡同时发育，但由于每个卵泡的Gn阈值及其对FSH 的反应不同，很难完全克服卵泡发育不同步的现状。既往有学者针对这一状况提出了一些观点，如李豫峰等［14］和吕群等［6］的研究认为，提前对发育不同步的大卵泡进行穿刺抽吸，有利于剩余卵泡同步发育从而获得更好的妊娠结局；而贾学玲等［7］则认为若能充分考虑患者卵巢储备功能等因素，不对大卵泡进行穿刺，仅调整GnRH-a或Gn启动剂量亦可以改善卵泡发育不同步的现象；亦有研究证实，适当联用HMG 也可以促进卵泡同步发育，从而获得更好的临床结局［9］，且与穿刺抽吸治疗卵泡发育不同步比较，不进行大卵泡穿刺、仅调整Gn使用剂量来调节卵泡发育所获得的临床结局并无差异［7］。但未行大卵泡穿刺、仅调整Gn用量的患者中，取卵日出现不获卵的情形并不少见，即卵巢功能性囊肿。卵巢功能性囊肿被认为来源于卵泡［15］，其发生与促排卵药物的应用有关［16-17］，该类囊肿穿刺抽吸后仅可见到少量颗粒细胞。

本研究回顾性分析了在北京大学深圳医院生殖医学科行IVF／ICSI-ET 治疗、卵泡发育不同步患者的临床资料，探讨卵泡发育不同步且未行大卵泡穿刺的患者中，取卵日获卵和无卵这两种情形是否会对后续的受精、胚胎发育及临床结局产生影响。本研究中，两组患者均行促排卵治疗，卵泡大小达到停药标准时注射HCG，34～36h后行取卵术，A 组的卵母细胞成熟率（91.21%）较B 组（86.46%）升高（P＜0.05），这可能与B 组的大卵泡抑制其他卵泡发育有关，B组大卵泡发育速度较快，以旁分泌或自分泌的形式持续性作用于邻近卵泡，抑制了毗邻卵泡的成熟。另外，A 组的2PN 卵裂率（98.74%）亦高于B组（96.54%）（P＜0.05），这可能与卵母细胞质量有关，如前文所述，A 组具有更高的卵母细胞成熟率，故而有更好的发育及卵裂潜能。而对两组患者的促排卵用药情况、促排卵效果及妊娠结局等进行比较后发现，两组的Gn 总量、Gn 天数、基础FSH、基础E2、基础LH、移植日子宫内膜厚度、HCG 日LH、HCG 日E2、HCG 日P水平、平均获卵数、平均移植胚胎数、2PN 正常受精率、优质胚胎率、胚胎种植率及临床妊娠率，差异均无统计学意义（P＞0.05），提示取卵日获卵或无卵并不影响后续ET 及临床妊娠结局。这可能是因为卵母细胞成熟、受精和胚胎发育是个复杂的动态过程，在整个胚胎发育的过程中，还存在诸多其他因素，例如体外培养的环境因素、卵母细胞及胚胎的超微结构、胚胎发育潜能、子宫内膜容受性等，影响正常受精、胚胎发育与种植及最终的临床妊娠［18-19］。而对于卵泡发育不同步的患者，大卵泡中有或无卵母细胞对卵母细胞成熟率和2PN 卵裂率的影响更为直接，其具体机制有待于进一步研究讨论。

综上所述，对于COH 过程中出现卵泡发育不同步且未行大卵泡穿刺的患者，通过调整Gn用量来调节卵泡发育，之后取卵日卵泡穿刺获卵与否可能并不影响患者最终的临床妊娠结局，但其具体机制尚需进一步的研究探讨。本研究结果也进一步佐证，对于卵泡发育不同步的患者，通过调整Gn用量来调节卵泡发育在临床上实效、可行，且更安全经济。

［1］ Verberg MF，Eijkemans MJ，Macklon NS，et al.The clinical significance of the retrieval of a low number of oocytes following mild ovarian stimulation for IVF：a meta-analysis［J］.Hum Reprod Update，2009，15：5-12.

［2］ Bosch E，Ezcurra D.Individualised controlled ovarian stimulation（iCOS）：maximising success rates for assisted reproductive technology patients［J］.Reprod Biol Endocrinol，2011，9：82.

［3］ Acosta TJ.Studies of follicular vascularity associated with follicle selection and ovulation in cattle［J］.J Reprod Dev，2007，53：39-44.

［4］ Miyano T，Manabe N.Oocyte growth and acquisition of meiotic competence［J］.Soc Reprod Fertil Suppl，2007，63：531-538.

［5］ 徐玉萍，曹云霞，章志国，等.卵泡发育速度对胚胎发育及体外受精-胚胎移植结局的影响［J］.安徽医科大学学报，2006，41：462-465.

［6］ 吕群，张潇潇，杨业洲，等.控制性促排卵中大卵泡穿刺的研究［J］.四川医学，2009，30：1052-1054.

［7］ 贾学玲，顾崇娟，石馨，等.大卵泡穿刺抽吸用于GnRH-a长方案卵泡发育不同步时对IVF-ET 结局的影响［J］.实用妇产科杂志，2013，29：125-128.

［8］ 麦庆云.降调节后超排卵过程中的卵巢囊肿形成与卵泡发育不同步的关系［J］.生殖医学杂志，2013，22：778-781.

［9］ Albuquerque LE，Saconato H，Maciel MC，et al.Depot versus daily administration of gonadotrophin releasing hormone agonist protocols for pituitary desensitization in assisted reproduction cycles［J］.Cochrane Database Syst Rev，2005，（1）：CD002808.

［10］ Brinsden PR.A textbook of in vitro fertilization and assisted reproduction［M］.3rd.New York：The Parthenon Publishing Group Inc，1999：1996.

［11］ Smacklon N，Fauser BC.Regulation of follicle development and novel approaches to ovarian stimulation for IVF［J］.Hum Reprod Update，2000，6：307-312.

［12］ Porter RN，Smith W，Craft IL，et al.Induction of ovulation for in-vitro fertilisation using buserelin and gonadotropins［J］.Lancet，1984，2：1284-1285.

［13］ 李洁，徐慧灵，夏婷婷.降调节COS方案中的卵泡发育不同步［J］.生殖医学杂志，2009，18（增刊1）：47-49.

［14］ 李豫峰，方春霞，章汉旺，等.超排卵中卵泡发育不均匀不同处理 方 法 的 临 床 观 察［J］.中 国 妇 幼 保 健，2011，26：4390-4393.

［15］ Jenkins JM，Anthony FW，Wood P，et al.The development of functional ovarian cysts during pituitary down-regulation［J］.Hum Reprod，1993，8：1623-1627.

［16］ Mitwally MF，Casper RF.Use of an aromatase inhibitor for induction of ovulation in patients with an inadequate response to clomiphene citrate［J］.Fertil Steril，2001，75：305-309.

［17］ 方春霞，付伟平，王丽萍.体外受精-胚胎移植周期中促性腺激素释放激素激动剂诱发的卵巢囊肿穿刺对临床结局的影响［J］.生殖医学杂志，2013，22：413-417.

［18］ 金海霞，孙莹璞.人类卵母细胞超微结构的研究进展［J］.国外医学（计划生育分册），2004，23：137-140.

［19］ 张胜坤，曹义娟，张蓓，等.体外受精-胚胎移植周期临床妊娠影响因素的研究进展［J］.中华妇幼临床医学杂志（电子版），2013，9：546-549.