补骨脂素和女贞子对小鼠B16黑素瘤细胞c-KIT表达的影响

霍 晶，宋新峰

白癜风是一种由于黑素细胞选择性破坏引起的特征性色素脱失斑，治疗棘手，患者遍布世界各地，约占世界人口的1%～2%。我国中药治疗白癜风历史悠久，但中药治疗白癜风的作用机制不清。以往研究大多集中在中药对黑素细胞增生和对黑素细胞酪氨酸酶的激活，促进黑素合成等方面[1,2]。但是白癜风病变部位的复色是黑素细胞激活-移行-增生-合成黑素的一系列过程，而移行能力的改变在白癜风发病和复色过程中尤为重要。本实验研究了中药补骨脂素和女贞子对黑素细胞c-KIT 表达的影响及意义，探讨中药补骨脂素和女贞子治疗白癜风的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠B16 黑素瘤细胞株（中国科学院上海细胞研究所），RPMI1640 培养基（美国Gibco 公司），10%胎牛血清（中国医学科学院血液学研究所）；兔抗c-KIT 抗体、β-肌动蛋白抗体、二抗山羊抗兔抗体（Santa Cruz 公司）；女贞子（北京同仁堂药店），补骨酯素单体（monomer）（成都瑞芬思生物科技有限公司）；Access RT-PCR system 试剂盒（美国Promega 公司），SDS-PAGE 胶（Invitrogen 公司），Bio-Rad 蛋白分析试剂盒，蛋白标准分子量（Bio-Rad 公司），96 孔培养板和Transwell 小室（上海生工生物技术服务有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 中药提取和B16黑素瘤细胞培养 ①中药制备：女贞子4 g，经70%乙醇60 ml 浸泡1周，加热回流提取3次，提取液过滤并浓缩浓度为 500 g/L，一次性滤器过滤除菌，4℃贮存备用。中药单体补骨脂素以二甲基亚砜溶解至50 mmo1/L贮存液，–20 ℃冻存。药物用时以RPMI1640培养基稀释至所需浓度。②黑素瘤细胞培养：小鼠B16黑素瘤细胞， RPMI1640培养基＋10%胎牛血清，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每3天换液1次。取对数生长期细胞，以1×105/ml接种于6孔板，细胞达50%融合时处理组加入中药。女贞子用无血清 RPMI1640培养基稀释，设定最终浓度梯度为 0.01、0.1、1.0 g/L；补骨脂素贮液用RPMI1640培养基稀释至终浓度梯度为1.0×10-7mmol/L，1.0×10-6mmol/L和 1.0×10-5mmol/L。以不加药物单纯加培养基组作为空白对照组。

1.2.2 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定c-KIT mRNA 表达 将B16 黑素瘤细胞以105个/ml 接种于培养板，24 h 后分别用含1.0×10-5mmol/L 的补骨脂素和1 g/L 女贞子的新鲜培养基换液1 次，72 h 后消化细胞（操作过程避光进行），按照Trizol 试剂盒提供的说明书提取细胞总RNA。然后采用一步法RT-PCR 试剂盒进行RT-PCR。引物（上海生工生物技术服务有限公司合成），c-KITm-F：5'-GGA AAG AAG ACA ACG ACA CG 3' ；c-KITm-R ：5'-ACA GAC ACA ACA GGC ACA GC3'； 肌 动蛋 白m-F：5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3'；肌动蛋白m-R：5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3'。

整个过程在DNA 扩增仪中自动完成。RT-PCR产物加入含溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶中电泳，电泳完毕后在凝胶扫描仪上观察结果，拍照记录并用Quantity One-4.3.0 软件（Bio-Rad）对扩增产物进行光密度分析。

1.2.3 蛋白质印迹法（Western blot）测定c-KIT 蛋白表达 用1.0×10-5mmol/L 的补骨脂素和1 g/L 女贞子处理黑素瘤细胞，培养3 d 后冰上收集、裂解细胞（操作过程避光进行）。根据上清液中总蛋白的浓度，加蛋白上样缓冲液，使样品中总蛋白的浓度为20 μg/μl，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转 PVDF 膜，用5%牛奶封闭。加入（1∶1 000）兔抗c-KIT 抗体，（1∶10 000）兔抗肌动蛋白等抗体，4 ℃孵育过夜，继而与1∶4 000的二抗羊抗兔抗体等室温反应1 h，常规洗膜。化学发光法显色、显影、定影，读取结果。用Quantity One-4.3.0 软件读取蛋白条带的灰度值。

1.2.4 B16 黑素瘤细胞迁移功能测定 Transwell 小室用8.0 μm 微孔聚碳酸酯膜分成上下2 室，实验前1 d 取出上层小室，将小室底面的聚碳酸酯膜用FN包被，超净台室温过夜晾干。将黑素瘤细胞接种于上层小室，嵌入Transwell 小室中，下层小室加入不同浓度药物处理，培养20 h 后取出聚碳酸酯膜（操作过程避光进行）。甲醇固定，甲苯胺蓝染色，膜上层的黑素瘤细胞用棉拭擦去，迁移至膜下层细胞在高倍镜下随机选取4 个视野计数，试验重复3 次。

1.3 统计学方法

计量数据以均数± 标准差表示， 应用SPSS15.0 统计软件进行统计分析。两样本均数的比较采用成组t 检验（two-sample group t-test）。多样本均数的组间差异采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），多样本均数的两两比较采用Dunnett-t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补骨脂素和女贞子对B16黑素瘤细胞c-KIT的mRNA表达影响

1.0×10-5mmol/L 补骨脂素处理组和1.0 g/L 女贞子处理组黑素瘤细胞的c-KIT mRNA 表达结果分别为（1.704±0.001）（IOD/Area）、（1.598±0.001）（IOD/Area），比对照组（0.812±0.001）（IOD/Area）增加了85.36%和67.52%，差异有统计学意义（t=3.36，P ＜0.05；t=2.78，P ＜0.05)。这表明补骨脂素和女贞子能促进小鼠B16 黑素瘤细胞c-KIT 的mRNA 表达（图1）。

图1 RT-PCR测定补骨脂素和女贞子对黑素细胞c-KIT mRNA表达电泳图

2.2 补骨脂素和女贞子对B16黑素瘤细胞c-KIT蛋白表达的影响

1.0×10-5mmol/L 补骨脂素处理组和1.0 g/L 女贞子处理组黑素瘤细胞c-KIT 的蛋白表达分别比对照组增加了119.78%和45.67%，差异有统计学意义（t=4.72，P ＜0.05；t=2.36，P ＜0.05)。这表明补骨脂素和女贞子能促进小鼠B16 黑素瘤细胞c-KIT蛋白的表达（图2）。

图2 蛋白质印迹法测定补骨脂素和女贞子对黑素瘤细胞c-KIT蛋白表达的电泳图

2.3 补骨脂素和女贞子对B16黑素瘤细胞迁移功能的影响

补骨脂素1.0×10-7mmol/L 组，1.0×10-6mmol/L 组和 1.0×10-5mmol/L 组处理20 h 后，迁移到Transwell小室膜下层的B16 黑素瘤细胞个数每视野分别为（45.3±25.0）个，（48.9±26.0）个，（57.7±31.0）个，对照组为（17.3±7.0）个。对组间均数比较采用单因素方差分析，结果显示，组间差异显著（F=10.562，P ＜0.05），与对照组两两比较，差异有统计学意义（t=4.16，P ＜0.05；t=4.38，P ＜0.05；t=4.87，P＜0.05），且与浓度增加呈剂量依赖性。

女贞子0.01 g /L 组，0.1 g /L 组和1.0 g /L 组处理20 h 后，迁移到Transwell 小室膜下层的黑素瘤细胞个数每视野分别为（46.6±24.0）个，（50.7±23.0）个，（56.7±36.0）个，未用药组为（17.3±7.0）个。对组间均数比较采用单因素方差分析，结果显示，组间差异显著（F=12.004，P ＜0.05），与对照组两两比较，差异有统计学意义（t=4.22，P ＜0.05； t=4.56，P<0.05；t=4.79，P ＜0.05），且与浓度增加呈剂量依赖性。

3 讨论

白癜风是一种常见的色素性皮肤病，其对美容所造成的损害严重影响了患者的生活质量。研究发现[3]，窄谱中波紫外线（NB-UVB）对深肤色人种（主要是印度人）白癜风是有效而安全的。但是，某些白癜风患者单单依靠NB-UVB 治疗是无效的，此种情况下，内服或外用补骨脂素长波紫外线（PUVA）照射能使白癜风色素减退皮损复色，是较为理想的替代疗法[4]。目前应用传统中药治疗白癜风取得了明显的疗效，临床上能观察到白斑区复色、毛囊周围出现色素岛，提示与黑素细胞的迁移以及黑素合成有很大关联[5]。

补骨脂素治疗白癜风的作用机制还不清楚。有研究表明补骨脂素可以刺激酪氨酸酶mRNA 转录起始的一种关键性转录因子-Mitf 的表达[6]，并表明补骨脂素诱导黑素生成作用与蛋白激酶A(PKA)信号传导途径参与调节有关[7]。有研究发现中药女贞子能激活酪氨酸酶，促进黑素合成[8]；进一步研究还发现女贞子能促进小鼠毛囊的生长。白癜风复色一方面是促使黑素细胞的活性增强，黑素合成能力增强；另一方面是促进黑素细胞的迁移功能。因此综合研究中药补骨脂素和女贞子对黑素细胞迁移的影响，对深入探讨中药治疗白癜风的机制具有重要意义。

c-KIT 是一具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，对黑素细胞迁移和生长存活有重要作用。Noriss 等[9]发现正常人也有一定水平的c-KIT 基因表达，并指出可能与保持正常黑素细胞的分裂潜能有关，c-KIT表达减少很可能会导致黑素细胞生长存活缺陷，成为白癜风皮损中黑素细胞丢失的一个主要原因。研究发现，c-KIT 还能通过对酪氨酸酶蛋白磷酸化修饰，激活酪氨酸酶，促使黑素生成增加[10]。目前认为白癜风色素恢复的主要机制是毛囊外毛根鞘无黑素细胞激活合成黑素，并向表皮迁移所致。因此，c-KIT 在黑素细胞迁移，从而在白癜风复色中发挥重要作用。

本实验结果显示，不同浓度补骨脂素对B16 黑素瘤细胞迁移均有显著促进作用，且与浓度增加呈剂量依赖性关系。补骨脂素10-5mmol/L 剂量组促进B16 黑素瘤细胞的c-KIT 蛋白表达增加119.78%。这提示临床上补骨脂素治疗白癜风的有效机制可能与促进c-KIT 表达，从而促进黑素细胞迁移有关。本研究还证实，女贞子处理后B16 黑素瘤细胞的迁移能力显著增强，c-KIT 蛋白表达明显增加，增幅达到45.67%，提示女贞子治疗白癜风的有效机制可能与促进c-KIT 表达，从而促进黑素细胞迁移有关。

本研究阐明了补骨脂素和女贞子对B16 黑素瘤细胞迁移的具体分子作用机制，表明了补骨脂素和女贞子治疗白癜风有效性的作用机制；这为临床筛选中药治疗白癜风等色素性皮肤病的机制研究提供了新思路，为更加科学、合理、全面、有效地筛选针对色素性皮肤病的中药奠定了基础。

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