HPLC 法测定骨质增生散中补骨脂素与异补骨脂素的含量

朱艳红 包长龙

内蒙古自治区通辽市食品药品检验所，内蒙古 通辽 028000

骨质增生散是由白花蛇舌草、乌梢蛇、补骨脂、乳香、没药、槲寄生、西红花、熟地黄、杜仲、牛膝十味药组成的复方制剂。功能主治为各部位骨质增生。补骨脂为该方中主要成份［1］之一，具有温肾助阳、腰膝冷痛、肾虚作喘功效。对本方的临床疗效有重要作用，以补骨脂中主要有效成分补骨脂素与异补骨脂素为定量监控指标可有效地控制产品的质量。本文采用HPLC法测定其中补骨脂素与异补骨脂素的含量，方法简单、准确、重现性好。可作为质量控制的方法。

1 仪器与试剂

岛津LC－10AT高效液相色谱仪，SPD－10Avp检测器、SIL－HTA自动进样器、CLASS－VP工作站组成。甲醇为色谱纯，水为高纯水。补骨脂素 (中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。批号:110739－200613)与异补骨脂素 (中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。批号:110738－200309)。骨质增生散 (批号:20070608、20081003、20091002)由通辽市科左中旗蒙医院制剂室提供。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18柱 (250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇－水 (45:55)，柱温:40℃，检测波长为206nm，流速为1.0mL/min，进样量10μL。理论板数:按补骨脂素峰计算应不低于3000，补骨脂素峰与异补骨脂素峰与相邻色谱峰的分离度大于2.5。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，加甲醇制成每 1ml分别含 0.02015mg、0.02114mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液 取骨质增生散粉末约1.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理 (功率300W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备 按照处方比例并以相同工艺制备缺补骨脂的阴性样品，按“2.3”项下方法制成阴性对照溶液。

2.5 干扰实验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，结果:阴性对照溶液色谱中，在与补骨脂素对照品与异补骨脂素对照品以及供试品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现。故认为阴性对照无干扰，色谱图见图1。

2.6 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下对照品溶液2、6、8、10、15、20、30μL分别进样。以峰面积为纵坐标 (Y)，以对照品进样量为横坐标 (X)，绘制标准曲线。补骨脂素进样量在0.02442～0.36624μg范围内线性关系良好。异补骨脂素进样量在0.02808～0.4212μg范围内线性关系良好。回归方程分别为:

2.7 精密度试验

取“2.2”项下的对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，补骨脂素色谱峰面积的RSD(n=6)为1.5%。异补骨脂素色谱峰面积的RSD(n=6)为1.3%。

图1 HPLC色谱图

2.8 重复性试验

精密称取同一批样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析测定。结果补骨脂素与异补骨脂素含量和的平均值 (n=6)为0.47mg·g－1，RSD为1.5%。

2.9 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温放置，分别于0，2，4，6，8，12，24h按上述色谱条件测定。测得补骨脂素的平均峰面积为848530，RSD(n=6)为1.3%;异补骨脂素平均峰面积为790053，RSD(n=6)为1.2%。结果表明供试品溶液室温放置24h内稳定。

2.10 回收率试验

精密称取已知含量的样品约0.7g，共6份，分别精密加入补骨脂素与异补骨脂素对照品溶液适量，按“2.3”项下方法操作，测定含量，并计算回收率。结果见表1。补骨脂素平均回收率 (n=6)为100.3%。异补骨脂素平均回收率 (n=6)为102.5%。

2.11 样品测定

取骨质增生散，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，记录色谱峰面积，计算含量。结果见表2。

表1 骨质增生散中补骨脂素的回收率

表2 骨质增生散中异补骨脂素的回收率

表3 骨质增生散中补骨脂素与异补骨脂素的含量和测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 测定波长的选择

配制一定浓度的补骨脂素与异补骨脂素对照品溶液，分别在200～500nm波长内进行全扫描，补骨脂素与异补骨脂素在206nm处均有较强的紫外吸收。实验选择206nm进行测定。

3.2 提取方法的考察

根据补骨脂素、异补骨脂素性质，结合本品剂型的特点曾先后采用取本品加甲醇超声30分钟、40分钟、50分钟，及加甲醇索氏提取2小时的方法提取供试品，供试品含量测定结果基本相同，前一种提取方法简便省时，故选定加甲醇超声30分钟制备供试品溶液。

3.3 据文献［2－6］采取补骨脂素与异补骨脂素含量的和作为补骨脂药材的质量标准，故本研究也采用两组分的和来做质量研究。

3.4 本文建立了一种准确可靠、专属性强、简单快捷的定量方法，通过对补骨脂素、异补骨脂素的含量测定，达到控制该制剂质量的目的。

［1］苏子仁，徐必达，刘庆思.补骨脂素、异补骨脂素在骨康提取精制过程中化学转化的研究［J］.中国实验方剂学杂志，1997，3(6):1.

［2］陆蓓，吴韶铭.HPLC法测定益肾灵颗粒中补骨脂素和异补骨脂素的含量［J］.中国药品标准，2002，3(4):23.

［3］王锦红，孙传梅.高效液相色谱法测定长寿长乐补酒中补骨脂素和异补骨脂素含量［J］.中国药业，2006，15(11):42.

［4］李学松，范兴东.补肾益脑胶囊中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定［J］.中成药，2006，28(6):810.

［5］常新全，丁丽霞.中药活性成分析手册［M］.学苑出版社，2002:1120－1120.

［6］中国药典［S］.一部，2010:174－174.