雄激素受体基因腺病毒载体的构建及对人毛乳头细胞增生的影响

兰雪梅，谭 欢，钟白玉，冯 林，杨希川

雄激素性脱发（androgenetic alopecia）是一种常见的脱发性疾病，其发病机制主要涉及脱发区雄激素受体（AR）表达增加、AR 活性增加、Ⅱ型5α 还原酶活性增加、下游细胞因子分泌异常等[1]。除毛囊干细胞[2]，毛乳头细胞（DPC）对毛囊的形态学发生及周期性生长调控具有重要的意义。体外培养人DPC，传代至3 代以后DPC 表达AR 的能力逐渐减弱[3]， DPC 作为雄激素性脱发的体外研究模型的可靠性有待进一步的提高。本研究通过构建AR 过表达腺病毒载体，并且转染DPC，为体外研究雄激素性脱发提供更理想的研究模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 标本来源于整形科手术且患有男性雄激素性脱发患者的顶部头皮。

1.1.2 主要试剂 AR 基因质粒（重庆金麦生物技术有限公司），胶原酶（Sigma 公司），分离酶（Sigma公司），AR 抗体为兔抗人单克隆抗体（Abcam 公司），CCK-8 试剂盒（碧云天公司），胎牛血清（Gibco 公司）。

1.2 方法

1.2.1 AR基因重组质粒的构建、腺病毒的包装及扩增 BglⅡ、XbaⅠ双酶切穿梭载体Adtrack-CMV及AR目的基因，酶切质粒转化E.coli DH10B细胞。筛选出具有抗卡那霉素的质粒，命名为Adtrack-AR。将鉴定正确的质粒用PmeⅠ线性化， pAdeasy和线性化的Adtrack-AR共电转感受态细菌BJ5183中，筛选出卡那霉素+氨苄青霉素+链霉素抗性的质粒，最终获得pAdeasy-Adtrack-AR酶切产物。将回收质粒转染密度为70%～80%的293T细胞，6～8 h后换含1%FBS的培养基，每日观察荧光的变化，待荧光增多，2/3细胞浮起时离心收集病毒液，将收集的病毒液加入密度为80%左右的293T细胞中，最后将收集的病毒液-80 ℃反复冻融3～5次，使细胞成分破裂，病毒释放出来，上清即为病毒原液。

1.2.2 二步酶法分离及培养 头皮标本用PBS 反复冲洗并剃净毛发，以无菌含1%青霉素-链霉素的D-hanks 液漂洗3 ～5 次，每次5 min。分离皮下筋膜，用无菌手术剪剪成0.3 ～0.5 cm 宽、3 ～4 cm 长的皮条，弃去真皮部分，将皮下脂肪保留。加入0.5%的分离酶4 ℃浸泡过夜，再放入37 ℃恒温冰箱消化30 min，D-hanks 液清洗及挤出毛干，再将脂肪条剪成浆糊状，加入0.2%Ⅳ型胶原酶37 ℃消化4 ～6 h，当出现梨形的毛乳头时即可终止消化。最后离心获得毛乳头，接种于含1%FBS 的高糖DMEM 培养基中，在37 ℃、5%CO2条件下培养。3 ～6 代毛乳头细胞用于实验。

1.2.3 免疫荧光检测AR的表达 将DPC接种于6孔板盖玻片上，制作细胞AR重组腺病毒转染DPC的细胞爬片，加入AR抗体4 ℃过夜，加入FITC标记的二抗，孵育，封片，最后共聚焦显微镜下观察转染情况。

1.2.4 蛋白质印迹法（Western blot） 收集AR 重组腺病毒组、空载体腺病毒组、对照组（未添加病毒）的DPC，加入蛋白裂解液，收集蛋白，AR 单克隆抗体孵育过夜，二抗孵育。

1.2.5 CCK-8法 AR重组腺病毒组、空载体腺病毒组、对照组分别于转染后48 h加入10 μl的CCK-8溶液，37 ℃培养箱孵育1 ～4 h，酶标仪450 nm处测吸光度（A）值。

1.3 统计学方法

AR 蛋白灰度值除以内参蛋白灰度值得到A 值，即AR蛋白的相对含量，以均数±标准差表示。应用SPSS 18.0统计软件进行分析，多组均值比较用单因素方差分析，P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pAdeasy-Adtrack-AR腺病毒载体的鉴定

质粒由重庆金麦生物技术有限公司测序，证实pAdeasy-Adtrack-AR 腺病毒载体的序列正确，说明AR 基因的重组腺病毒载体构建正确。

2.2 第3、6、9代毛乳头细胞AR检测

同一瓶原代DPC 传代至3、6、9 代，然后进行蛋白质印迹检测。3 代DPC 的AR A 值（0.466±0.131）明显高于6 代（0.209±0.051）及9 代（0.334±0.11）DPC 的AR A 值，且3 代AR A 值与6 代AR A 值差异有统计学意义（P=0.025），表明在传代过程中AR蛋白的表达量不稳定（图1）。

2.3 腺病毒转染后免疫荧光检测

重组腺病毒组于转染后48 h 在共聚焦显微镜下观察病毒转染效率，转染效率达80%以上（图2）。

2.4 腺病毒转染后蛋白质印迹检测

图1 第3、6、9代毛乳头细胞AR表达电泳图

图2 AR重组腺病毒组转染48 h后免疫荧光图（×200）

腺病毒转染DPC 后24、48、72 h 分别检测其AR 的表达量。重组腺病毒转染后48 h 时，AR 蛋白的表达量明显升高，转染72 h 时AR 蛋白的表达量较48 h 时明显降低，转染后48 h 组与空载体组、空白对照组、转染后24 h 组、转染后72 h 组相比差异有统计学意义（P=0.006），说明转染后48 h AR 表达最高（表1，图3）。

表1 AR重组腺病毒转染后蛋白质印迹检测AR的表达

图3 各组DPC转染后AR的表达电泳图

2.5 腺病毒转染后CCK-8法检测

腺病毒转染后24、48、72 h，采用CCK-8 法检测其对DPC 增生的影响。AR 重组腺病毒组、空载腺病毒组、对照组DPC 细胞增生率差异无统计学意义（表2）。

表2 AR重组腺病毒转染后CCK-8检测结果

3 讨论

雄激素性脱发的发病依赖于多种因素，包括遗传、雄激素量、雄激素受体、Ⅱ型5α 还原酶等[4]。研究发现雄激素性脱发的发病与血液循环中的雄激素量无关，而与局部的雄激素量有关。毛囊是雄激素的作用位点，同时它作为一个外周器官可通过自分泌或旁分泌的形式合成雄激素。在头皮顶部雄激素由Ⅱ型5α 还原酶转变为双氢睾酮，后者与雄激素受体结合导致了雄激素性脱发的发生。雄激素性脱发患者头顶部Ⅱ型5α 还原酶的含量高于健康志愿者[5]，由于头皮局部Ⅱ型5α 还原酶的差异导致了头皮枕部及顶部毛发生长存在差异。有研究者发现雄激素性脱发患者头顶部DPC 内AR 的量要明显高于正常人头顶部[6]。在雄激素性脱发发病机制中，AR 和Ⅱ型5α 还原酶均作为发病的关键调控点[7]。

AR 是一种细胞内转录因子，它属于类固醇/核受体超家族[8]。AR 由热休克蛋白70、90、56 组成，当雄激素与AR 相结合后热休克蛋白分解，从而暴露了核转录信号，使雄激素受体配体复合物运输至核内，进而与雄激素调控基因相结合[9]。在此过程中刺激或抑制信使蛋白或者AR，均可以刺激或者抑制毛囊的生长[10]。

本次实验观察到，第6 代DPC 内的AR 明显降低，从而影响了体外研究雄激素性脱发的发病机制的可靠性。并且既往研究证实了DPC 传代至第3 代以后AR 的表达量会逐渐降低甚至消失[11]。与文献报道不同的是，本实验同一瓶细胞传至第9 代时，AR 的表达量较第6 代DPC 的AR 量升高，但两者的差异无统计学差异，可能是由于AR 的合成还存在着一定的代偿机制。

蛋白质印迹检测结果显示，毛乳头细胞转染AR重组腺病毒载体后，AR 蛋白的表达量较对照组及空载体组会升高，尤其在转染后48 h，充分说明了AR重组腺病毒载体构建成功。当腺病毒转染毛乳头细胞72 h 后，AR 蛋白表达下降，这可能是由于腺病毒不整合至毛乳头细胞的基因组，病毒基因组在宿主细胞内不能进行扩增，AR 基因瞬时表达，因而AR 的表达最终会因为细胞的增生分裂而稀释；也可能是由于有负反馈调节机制参与AR 基因的复制、转录、翻译。

在既往研究中，当干扰前列腺癌细胞中AR 的表达时，前列腺癌细胞的增生率会下降[12]。而在本次实验中，AR 重组腺病毒载体未抑制毛乳头细胞的生长，说明转染并未明显影响DPC 的正常增生功能，且更能接近毛乳头细胞的正常生理状态。

在以往的研究中，研究者通过AR 质粒型表达载体来弥补毛乳头细胞AR 基因衰减这一难题，但是前者的转染效率低[11,13]，且转染困难。本实验通过构建AR 重组腺病毒载体，转染效率高，在一定程度上为研究雄激素性脱发提供了更理想的体外研究模型。但是本研究也存在一定的局限性：腺病毒表达系统仅瞬间表达，AR 基因不能稳定表达，不能完全解决AR 蛋白随着传代而衰减的问题，可以通过重复瞬时转染腺病毒或者通过构建AR 慢病毒载体来进行下一步的研究；并且本次实验着重以AR 为研究点，而未全面涉及到雄激素性脱发发病的其他因素，AR 表达量增加是否会影响Ⅱ型5α 还原酶的表达，是否使下游信号通路发生转变[14]，还有待今后进一步的研究。

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