云南传统发酵豆豉中细菌的分离与分子鉴定

郑多多，王文思，杨中苹，付晓萍，李凌飞

（云南农业大学食品科学技术学院，昆明　650201）

云南传统发酵豆豉中细菌的分离与分子鉴定

郑多多，王文思，杨中苹，付晓萍，李凌飞*

（云南农业大学食品科学技术学院，昆明650201）

目的：为了明确云南传统发酵豆豉中细菌的种类，对云南传统发酵的豆豉进行研究。方法：采用平板稀释法进行菌种分离，利用分子生物学方法对分离到的菌株进行鉴定。结果：随机选择的130株细菌菌株属于3个属5个种，分别是芽胞杆菌属（Bacillus）3个种、葡萄球菌属（Staphylococcus）1个种和肠杆菌属（Enterobacter）1个种。其中枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）占所分离菌株的79．23%，是云南传统发酵豆豉的优势菌。结论：分离出的枯草芽胞杆菌有望作为实现云南传统发酵豆豉纯种发酵的主要菌种。

云南传统发酵豆豉；细菌；分子鉴定

［DOI］10．3969∕j．issn．1672-2345．2015．02．018

豆豉是以黑豆、黄豆为原料经微生物发酵而制成的传统发酵食品。豆豉除含有人们熟悉的优质蛋白、必需脂肪酸外，在其加工过程中能生成多种有利人体消化吸收的发酵产物、提高了维生素B的含量，是纯天然的功能性食品〔1〕。中医认为，豆豉具有解表清热、透疹解毒的功效〔2〕。

微生物对豆豉的品质及风味形成起着至关重要的作用〔3〕。我国主要生产毛霉型、曲霉型及少量的细菌型豆豉〔4〕。研究发现，国内细菌型豆豉发酵的微生物主要有豆豉芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌〔5〕、乳酸菌和微球菌等。目前国内豆豉的生产多以自然发酵为主，尚未实现纯种发酵，存在生产方式落后、产品质量不稳定和食品安全（受致病菌污染）等问题。因而有必要加大科研开发力度，本研究以云南传统发酵豆豉为研究对象，对云南传统豆豉发酵过程中的细菌种类、数量以及优势菌群进行研究，分析探讨可用于豆豉纯种发酵的优势菌株。这对实现云南豆豉纯种发酵，确保产品品质和食品安全性，推动云南豆豉产业发展具有重要意义。

1　材料与方法

1．1材料本实验的豆豉样品采集自云南昆明、通海、建水等地，为云南传统发酵豆豉。营养琼脂培养基（青岛海博生物技术有限公司）；细菌DNA提取试剂盒（北京三博远志生物技术有限责任公司）；Premix Taq（宝生物工程有限公司）；细菌通用引物799f∕1492r、BM2000 DNA Marker（上海超研生物科技有限公司）；Tris碱、盐酸、冰乙酸、EDTA、琼脂糖、超纯水等。

1．2实验方法

1．2．1菌种的分离和纯化根据《中华人民共和国国家标准GB 4789．2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》〔6〕，对云南传统发酵豆豉中的细菌进行分离纯化。

1．2．2提取细菌基因组DNA从分离平板上随机选择130个细菌单菌落，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，方法参见试剂盒说明书。提取的DNA于-20℃保存备用。

1．2．316S rDNA的PCR扩增以基因组DNA为模板，采用细菌通用引物799f（5′-AACAGGATTAG⁃ATACCCTG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTACGACTT-3′）扩增细菌16S rDNA基因序列。PCR反应体系（50 μL）：2×PremixTaq（TaKaRa）25 μL；引物（10 μM）各2 μL；DNA模板1 μL；用无菌去离子水补至50 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，55℃退火1 min，72℃延伸70 s，进行30个循环；72℃后延伸7 min。用0．8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1．2．4测序及分析用DNA回收试剂盒回收PCR产物，并送至赛音生物技术（上海）有限公司进行DNA测序。所获得的DNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对分析。采用Mega 4．0软件构建系统发育树。

2　结果

2．1云南传统发酵豆豉中细菌的分离结果对云南传统发酵豆豉中的细菌进行分离。结果发现10-1～10-6稀释度的平板上都长出了大量菌落。通过菌落计数法计算得到豆豉样品中含有1．55×107个∕g菌落。从中随机选择130个菌株纯培养后进行分子鉴定。

2．2菌株16S rDNA的PCR扩增结果提取130株细菌的基因组DNA并以此为模板经PCR反应扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，均得到约750 bp的DNA片段。

2．3菌株16S rDNA序列的分析将所获得的130株细菌的DNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对，选择一些与测定序列同源性较高的已知种序列作为参考序列，构建系统发育树。系统发育分析表明，云南传统发酵豆豉中的细菌分属于3个属5个种，分别是芽胞杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（En⁃terobacter）和葡萄球菌属（Staphylococcus）。其中芽胞杆菌属包括枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）和短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）；肠杆菌属为产气肠杆菌（Entero⁃bacter aerogenes）；以及葡萄球菌属中一个尚不能确定具体种类的种（Staphylococcus sp．）。见图1。

图1　云南传统发酵豆豉中细菌的16S rDNA系统发育树

NCBI比对相似性均在99．00%以上，芽胞杆菌（Bacillus）是云南传统发酵豆豉中细菌的优势属，占所分离细菌菌株的95．39%，其中枯草芽胞杆菌（Ba⁃cillus subtilis）占79．23%，是云南传统发酵豆豉中的优势菌。见表1。

表1　云南传统发酵豆豉中各种细菌所占比例（n=130）

3　讨论

长期以来，对细菌的分类鉴定主要依靠菌落形态以及大量生理生化反应（比如糖发酵实验、硝酸盐还原实验、硫化氢产生实验等）鉴定，这种传统鉴定技术不仅花费时间长，而且准确性不够高，是我国传统发酵食品进一步发展的瓶颈。随着分子生物学和PCR技术的发展，16S rDNA鉴定技术在细菌鉴定方面得到应用，其鉴定指标单一明确，以细菌保守序列为基准，进行同源性分析，通过序列差异鉴定种属，具有准确、快速、灵敏的优点。正成为我国在传统发酵食品微生物研究等方面的关键技术。

豆豉的品质、生理功能特性与微生物息息相关，豆豉风味、色泽和生理功能的形成多是依靠微生物发酵及其代谢产生的多种酶系。国内对细菌型豆豉的研究主要集中在菌种筛选和发酵工艺优化等方面，前人研究发现参与细菌型豆豉发酵的微生物主要有豆豉芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、乳酸菌和微球菌等。

目前关于云南传统发酵豆豉中细菌的研究鲜见报道，只有昆明理工大学等人对豆豉中乳酸菌进行了研究，研究表明云南传统发酵豆豉中优势发酵乳酸菌主要为Lactobacillus sp．，Weissella sp．和Pediococcus sp．3个种属的乳酸菌〔7〕。乳酸菌通常是在豆豉后发酵过程中产生的，其基本不参与豆豉的初期发酵。因此，目前对于参与云南传统豆豉初期发酵的微生物知之甚少。本研究以云南传统发酵豆豉为研究对象，采用传统分离培养方法和分子生物学方法相结合，对云南传统发酵豆豉中的细菌进行了鉴定。避免了传统生理生化鉴定繁杂且鉴定结果准确性不高的缺点。

本研究的结果表明，芽胞杆菌属是云南传统发酵豆豉中的优势属，其中枯草芽胞杆菌占绝对优势（79．23%）。枯草芽胞杆菌是工业微生物的主力军之一，也是目前用于细菌型豆豉发酵的主要微生物。枯草芽胞杆菌被美国食品和药品监督局认为是GRAS（Generally regarded as safe，食品添加剂安全性评价指标）〔8〕，它是一些重要的传统大豆发酵食品如印度的Kinema、泰国的Thua-nao和西非的Daddawa中的优势菌〔9〕。早在日本平安时代日本人就已经利用枯草芽胞杆菌在大豆中采用固态发酵的方法生产纳豆，开创了利用枯草芽胞杆菌的历史。研究资料表明，枯草芽胞杆菌具有丰富的酶系，能够产生蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶、木聚糖酶、几丁质酶、谷氨酰胺酶等十几种酶〔10〕。这是豆豉中其他参与发酵菌种无法比拟的。枯草芽胞杆菌能产出黏性物质、其发酵产物纳豆具有抗菌、溶血栓、抗癌等功能，枯草芽胞杆菌还具有发酵周期短、产物丰富、可利用开发价值高以及作为食品、药品安全性好等优点。因此，本研究分离到的枯草芽胞杆菌有望作为实现细菌型豆豉纯种发酵的主要菌种。

地衣芽胞杆菌的作用机制是以菌治菌，活菌进入肠道后，对葡萄球菌、酵母菌等致病菌有拮抗作用，然而对双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、消化性链球菌具有促进生长作用，从而达到可调整菌群失调达到治疗目的〔11〕。

短小芽胞杆菌属于芽胞杆菌属，能水解淀粉，利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇产酸，利用丙酸盐，还原硝酸盐，分解酪氨酸。邱秀宝研究发现短小芽胞杆菌能够产生碱性蛋白酶〔12〕。

本研究还从豆豉中分离到了葡萄球菌属的细菌。葡萄球菌属的细菌是一群革兰氏阳性球菌，分布十分广泛。现已发现的葡萄球菌有30多种，大多数是不致病的腐生菌。葡萄球菌生化反应活泼，多数菌株能分解葡萄糖，产酸不产气〔13〕。国内外已有报道不同种葡萄球菌（包括木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、马胃葡萄球菌、肉葡萄球菌和模仿葡萄球菌）均可作为肉制品发酵剂并加以应用。赵振玲等在筛选葡萄球菌作为发酵剂香肠的研究中发现木糖葡萄球菌具有抗菌活性，且能水解蛋白质〔14〕。

此外，云南传统发酵豆豉中还存在极少数的产气肠杆菌。产气肠杆菌属于肠杆菌科肠杆菌属，能发酵乳糖产乳酸，对蔗糖的转化率较高且转化速率快，具有较好的应用前景〔15〕。产气肠杆菌主要生存于人类和动物的肠道，亦生存于水、土壤及腐败物中，为人体内的正常菌相，只有在人体虚弱的特殊情况下才偶尔引起疾病。研究表明，在传统中式发酵香肠体系中产气肠杆菌和阴沟肠杆菌存在协同作用，促进彼此生长，同时也增加它们产生物胺的能力〔16〕。生物体内适量的生物胺可促进正常生理活动，而过量的生物胺会导致生物体产生不良反应。生物胺已成为世界公认的对人体健康有潜在危害的物质。虽然本研究中产气肠杆菌所占比例仅为0．77%，不至于产生过量的生物胺，但仍然存在一定的食品安全隐患。

本研究的结果表明，枯草芽胞杆菌是云南传统发酵豆豉中的优势菌。我们用枯草芽胞杆菌对豆豉进行了纯菌种发酵初步研究，运用响应面分析法对豆豉的发酵条件进行了优化，在实验室内实现了云南豆豉的纯菌种发酵，纯种发酵的豆豉在外观、气味、口感等方面与自然发酵相近。可见，枯草芽胞杆菌可以作为实现云南细菌型豆豉纯种发酵的主要菌种来使用，对于今后进一步优选、优化生产菌种，实现豆豉的纯菌种发酵，有目的控制发酵方向，将豆豉生产向工业化、标准化方向转变，提高产品质量等方面有着重要的意义。

〔1〕卢露．豆豉发酵中微生物及其功能研究进展〔J〕．粮食与食品工业，2011，18（1）:42-45．

〔2〕黄欣．豆豉的研究进展〔J〕．中国食物与营养，2006（11）: 20-21．

〔3〕Ogawa，Yoshio．Anoriginalhabitatoftempehmolds〔J〕．Myco⁃science，2004（45）:271-276．

〔4〕黄基．豆豉发酵微生物的研究与应用〔J〕．学术论坛，2012（3）:54．

〔5〕袁贵英，石明生，姬长新，等．河南臭豆豉发酵微生物的分离鉴定〔J〕．江苏调味副食品，2007，24（2）:28-36．

〔6〕中华人民共和国卫生部．GB 4789．2-2010食品安全国家标准：食品微生物学检验菌落总数测定〔S〕．

〔7〕龚福明．云南传统发酵豆豉中乳酸菌多样性及高产γ-氨基丁酸乳酸菌研究〔D〕．昆明：昆明理工大学，2010．

〔8〕Schallmey M，Singh A，Ward O P．Developments in the use of Bacillus species for industrial production〔J〕．Can J Microbiol，2004，50（1）:1-17．

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〔10〕袁小平，王静，姚惠源．枯草芽胞杆菌内切木聚糖酶的纯化与性质研究〔J〕．食品与发酵工业，2004，30（8）: 55-59．

〔11〕李卓佳，曹煜成，陈永青，等．地衣芽胞杆菌De株的胞外产物对凡纳滨对虾脂肪酶活性影响的体外实验〔J〕．高技术通讯，2006，16（2）:1002-1006．

〔12〕邱秀宝．短小芽胞杆菌碱性蛋白酶BP的纯化和性质〔J〕．微生物学报，1994，34（4）:293-300．

〔13〕贾文祥．医学微生物学〔M〕．北京：人民卫生出版社，2009：82-87．

〔14〕赵振铃，孙春禄．发酵香肠中葡萄球菌发酵剂的筛选〔J〕．食品工业科技，2008，29（1）:126-128．

〔15〕徐忠义，王新磊，闫巧娟，等．产气肠杆菌发酵蔗糖产乳酸条件的优化〔J〕．中国酿造，2011（1）:78-81．

〔16〕李彬．产气肠杆菌（E.aerogenes）和阴沟肠杆菌（E.cloa⁃cae）产生物胺作用的研究〔D〕．南京：南京农业大学，2011．

（责任编辑李杨）

Isolation and Molecular Identification of Bacteria from Yunnan Traditionally Fermented Douchi

Zheng Duoduo,Wang Wensi,Yang Zhongping,Fu Xiaoping,Li Lingfei*
（College of Food Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China）

Objective:To study Yunnan traditionally fermented Douchi and to identify kinds of bacteria in it．Methods:The bacteria were isolated from Douchi by the dilution method,and 130 strains of bacteria were randomly selected and identified by the molecular methods．Results:130 strains isolated belonged to 3 genera and 5 species,including 3 species of the genus Bacillus,1 species of the genus Staphylococcus,and 1 species of the genus Enterobacter．Bacillus subtilis accounting for 79．23%was the dominant species of all the bacteria from Yunnan traditionally fermented Douchi．Conclusion:Bacillus subtilis was expected as the main strain for Yunnan Douchi to be purely fermented．

Yunnan traditionally fermented Douchi;bacteria;molecular identification

TS214．2

A

1672-2345（2015）02-0060-04

云南省教育厅基金资助项目（2012Y372）；云南农业大学学生科技创新创业基金资助项目（2014ZKX065）

2014-10-28

2014-11-10

郑多多，硕士研究生，主要从事食品微生物及分子生物学研究．

李凌飞，副教授，博士．