Claudin蛋白在急性肺损伤中的作用

刘　梅，邓星奇(综述)，李文放※(审校)

(1.第二军医大学长征医院急诊科，上海 200003； 2.上海市闵行区中心医院急诊科，上海 201101)

Claudin蛋白在急性肺损伤中的作用

刘梅1，邓星奇2(综述)，李文放1※(审校)

(1.第二军医大学长征医院急诊科，上海 200003； 2.上海市闵行区中心医院急诊科，上海 201101)

紧密连接是细胞黏附形式的一种，主要存在于上皮细胞间与内皮细胞间的连接复合体中，具有调控离子、溶液等屏障作用。密封蛋白(Claudin)是紧密连接结构分子，不同Claudin蛋白的表达影响细胞层中电解质和溶质的渗透率变化；病原体可以将Claudin蛋白作为目标入侵并削弱宿主的防御。最近的研究表明，Claudin蛋白和紧密连接避免了多细胞生物的感染和一些传染性疾病[1-3]。目前对Claudin蛋白的肺调节功能知之甚少，新的证据表明，环境的刺激可以影响人类疾病的蛋白表达和肺泡上皮屏障功能，而肺泡上皮屏障功能的减退可诱发许多肺部疾病，特别是急性肺损伤[4-5]。最近的数据表明，Claudin蛋白的差异表达影响急性肺损伤的上皮屏障功能变化[6]。现就Claudin蛋白在急性肺损伤中对肺泡上皮细胞屏障作用的最新研究进展予以综述。

1Claudin蛋白及其与肺泡上皮屏障功能的关系

1.1Claudin蛋白Furuse等[1]在1998年发现了紧密连接带中两种不同于闭合蛋白的紧密连接膜蛋白，分别包含了211个和230个氨基酸，亲水性分析发现其均有4个跨膜区，将其命名为Claudin-1和Claudin-2。Swisshelm等[2]于1999年首次克隆出了人类Claudin基因，到目前为止已有近30个家族成员被发现。Claudin是相对分子质量为20 000～27 000的4次跨膜蛋白，序列的一致性达到12.5%～69.7%；每一个Claudin分子均由4个跨膜结构组成，氨基和羧基末端均在细胞内，羧基末端富含丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基[3]。Claudin 亚型中第1和第4跨膜区的氨基酸序列具有高度保守性，而第2和第3跨膜区的序列则呈多样性[4]。Claudin中的半胱氨酸可能会形成分子内的或分子间的二硫键，除Claudin-12，所有人类的Claudin蛋白的C端均包含1个能让它们结合到支架蛋白上的PDZ的基序[5-7]。Claudin可以和同一细胞或相邻细胞中的Claudin蛋白连接[8-9]。Claudin一般只在一些特殊的Claudin之间形成异源二聚体，如Claudin-1和Claudin-4可以形成异源二聚体，但Claudin-1和Claudin-2之间则不能[8]。一般情况下，Claudin-2、Claudin-7、Claudin-10、Claudin-15和Claudin-16形成紧密连接处的毛细孔增加细胞膜离子通透性；而Claudin-4、Claudin-5、Claudin-8、Claudin-11、Claudin-14和Claudin-18则发挥锚定封闭的功能[9]。

1.2Claudin蛋白与肺泡上皮屏障功能紧密连接，又称封闭小带，是细胞膜共同构成的一个液体无法穿透的屏障在两个细胞间紧密相连的区域，它是一类只在脊椎动物中出现的细胞连接复合物。在无脊椎动物中，相应的连接为间壁连接。紧密连接主要执行3种功能：①将细胞固定在一起；②防止顶面和底侧面整合膜蛋白从侧面扩散，从而维持细胞的极性，允许每个表面的特异性功能得以保持，其目的在于跨膜运输；③防止分子、离子穿过细胞间隙[10]。因此，物质必须靠扩散或主动运输进入细胞才能通过该组织，该途径可有效控制通过紧密连接封闭上皮和内皮细胞间隙的物质种类。组成紧密连接的膜蛋白包括闭合蛋白、Claudin以及紧密连接相关蛋白zonula occludens protein 1(ZO-1)等。许多研究表明，Claudin蛋白间存在多样的相互作用形式，Claudin是形成紧密连接必不可少的成分并且与ZO-1调节的肌动蛋白细胞骨架有关[10-12]。屏障功能学概念已经发展了数十年，人们越来越关注Claudin在正常生理状况下以及疾病情况下对上皮屏障功能的调节作用[13]，但关于紧密连接在肺部的特点和调节机制还知之甚少。上皮组织的屏障作用对肺部行使正常生理功能具有重要作用，因此研究肺部Claudin蛋白的组成以及功能调节机制具有重要意义。肺上皮表面积约75 m2，整层上皮厚度不超过1 μm，每天却与外界交换8500 L气体；肺上皮由Ⅰ型和Ⅱ型两种上皮细胞组成，Ⅰ型上皮细胞占95%[4]。肺屏障由上皮和内皮构成，其中上皮组织起主要屏障作用。研究显示，仅上皮通透性的改变就足以引起肺水肿[14]，这是因为内皮渗透性的基线是相对较高的，如淋巴液的蛋白浓度可以超过血浆蛋白浓度的60%[7]。肺损伤时，细胞外环境因素刺激会改变Claudin表达而影响肺泡上皮屏障功能。Fernandez等[15]研究酒精摄入对Claudin在肺泡上皮细胞影响时发现，Claudin-5 增加会影响细胞旁路通透性，并且Claudin-1、Claudin-7 表达下降，这些变化可影响离子通透作用而进一步阻碍肺泡水肿液清除以及改变对蛋白的通透性。Wray等[16]的研究发现，无论是什么原因所引起的Claudin-4下降均将导致细胞间紧密连接的通透性增加，这一结果提示，Claudin-4在调节肺内液体平衡以及维持致密的肺泡上皮屏障中发挥了重要作用。

2Claudin蛋白与急性肺损伤

2.1Claudin在肺脏的表达分布至今，Claudin 在人类肺上皮细胞的精确表达谱还不完全清楚。为了明确哪些Claudin在肺上皮表达以及Caludin是如何影响肺上皮的屏障功能的，Frank[17]利用细胞特异性的分子标记流式分别分离得到大鼠的Ⅰ型和Ⅱ型肺上皮细胞，利用荧光定量聚合酶链反应技术发现，两种肺上皮细胞均表达Claudin-3、Claudin-4和 Claudin-18闭合膜蛋白；且在这两种上皮细胞中，3种Caludin占总闭合蛋白转录组的97%，但在两种肺上皮细胞中，每种Claudin所占的比例不同，Ⅰ型细胞主要表达Claudin-18，Ⅱ型则主要表达Claudin-3，Claudin-4在两类细胞中表达量均较高。这些结果表明，Claudin在肺组织中表达具有一定的细胞特异性。事实上，Claudin的表达也具有组织特异性。Claudin蛋白在皮肤、脑、神经系统、内脏组织中表达，大部分组织中表达2种以上Claudin，如肾脏中有Claudin-4和Claudin-8，而Claudin-1、Claudin-2、Claudin-3共同存在于肝脏中，也有一些组织紧密连接链中的Claudin是特定的，睾丸的足突细胞中主要表达的是单一的Claudin-11[4]。不同组织和细胞类型Claudin表达的不同与细胞旁路通透性的改变直接相关。

2.2Claudin与急性肺损伤急性肺损伤是各种直接或间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全。以肺容积减少、肺顺应性降低、通气/血流比例失调为病理生理特征，临床表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫，肺部影像学上表现为非均一性的渗出性病变，其发展至严重阶段(氧合指数<200)被称为急性呼吸窘迫综合征[18-22]。尽管Claudin蛋白表达的改变并不是调节细胞转运渗透率的唯一机制，但是Claudins在病理状态下表达的改变提示单个蛋白变化对上皮屏障功能的影响。在肺上皮主要表达的3种Claudin中，Claudin-4 和Claudin-18在急性肺损伤过程中有明显的表达变化[16,23-24]。有趣的是，它们的变化是相反的，Caludin-4在急性肺损伤中表达升高，而Claudin-18表达却下降。Claudin-4水平的变化非常迅速，在呼吸机诱导的小鼠急性肺损伤模型中其信使RNA的量在诱导后4 h增加了8倍[25]。关于Claudin-4 表达量增加的原因尚不完全清楚，但是一些数据表明，在培养的鼠和人的原代肺上皮细胞中，蛋白激酶C的激活能有效增加Claudin-4信使RNA的水平，而其下游的c-Jun氨基末端激酶的抑制则逆转了这一作用[25-26]。在这些原代的肺上皮细胞中，抑制胞外信号调节激酶1/2 和p38丝裂原活化蛋白激酶则没有改变蛋白激酶C调节的Claudin-4的诱导。值得注意的是，在Claudin-4转录起始位点的启动子区包括了一个保守的、潜在的磷酸酯酶activator protein 1(AP-1)结合序列，因此推测，c-Jun氨基末端激酶可能通过AP-1增加Claudin-4的表达。一些研究也表明，specificity protein 1(SP-1)和grainyhead样转录因子Ghl2对于Claudin-4的基本表达非常重要[25-26]。在培养的肺上皮细胞、犬肾细胞及鸡的肠上皮细胞中，表皮生长因子的刺激会增加Claudin-4的表达水平[25，27-28]。在A431癌细胞中，Claudin-4表达下降可能是表皮生长因子受体被抑制的一个蛋白标志；也就是说，表皮生长因子受体的激活上调Claudin-4表达[29]。有趣的是，在气管上皮细胞，表皮生长因子受体增强上皮屏障功能是依赖于c-Jun氨基末端激酶的激活[30]。另有研究表明，干扰素依赖于信号转导及转录激活因子2特异性地增加Claudin-4表达[31]。还有研究表明，在人克隆结肠腺癌细胞系中，黄酮类的槲皮黄酮特异性地诱导Claudin-4表达；激酶抑制剂H7和星状孢菌素能阻止这一效应[32]。这些抑制剂的靶点是蛋白激酶C和其他几种激酶。以上的这些实验结果组成了Claudin-4 表达调节机制的一个基础，但是在这些细胞系中发现的所有信号通路在体内是否影响Claudin-4的表达还未可知。在犬肾细胞的研究中显示，Claudin-4能形成一个相对的阴离子选择性细胞旁孔径通道[33]。尽管在犬肾细胞中干扰Claudin-4的表达会降低跨膜的电阻抗，但同时也导致了细胞旁路阴离子选择性的下降。研究表明，在肾脏上皮细胞中，With-no-lysine kinases 4(WNK-4)磷酸化Claudin-4能增加Claudin-4的膜定位且提高跨膜氯离子电导[34]，其原因是WNK-4在肾脏中是一个氯离子电导的激活剂。总之，这些研究认为，Claudin-4限制了跨膜离子运输，其对氯离子的屏障作用逊于钠离子。在原代培养的大鼠的肺泡上皮Ⅱ型细胞中，小干扰RNA干扰Claudin-4降低跨膜的抗电阻性但不会影响细胞旁大分子的渗透性[16]。在急性肺损伤小鼠模型中，Claudin-4的表达迅速且明显提高，在未受到损伤的小鼠体内研究中，产气荚膜梭菌肠毒素结合到Claudin-4和Claudin-3导致肺上皮液体清除率的明显下降，但不会影响大分子的通透；产气荚膜梭菌肠毒素会明显降低Claudin-4的表达，但对Claudin-3影响不大，其没有任何细胞毒性；当小鼠遭遇急性肺损伤时，产气荚膜梭菌肠毒素处理会发生更加严重的肺损伤以及肺水肿[34]。这些数据支持了Claudin-4在上皮屏障功能中起保护作用，并暗示Claudin-4可能是通过建立细胞旁的离子屏障以加速肺部液体的清除能力，从而达到限制肺水肿的目的。

2.3Claudin-3和Claudin-4对肺泡上皮屏障功能影响的差异Claudin-3和Claudin-4的同源关系最接近[35]。然而由于两者在肺泡中的表达模式明显不同，提示这两种Claudin蛋白在肺泡的屏障功能中充当着不同的角色。为了验证这一点，在滤膜培养的肺泡上皮细胞通过转导特异性高表达黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)标记的Claudin-3或者Claudin-4 的研究发现，YFP-Claudin-3或YFP-Claudin-4的表达对其他Claudin蛋白的表达或定位没有影响；但YFP-Claudin-3和YFP-Claudin-4对肺泡上皮的屏障作用产生了不同的影响，转导YFP-Claudin-4的肺泡上皮细胞的通透阻力提高了近50%，为Claudin-4改善肺泡屏障功能提供了直接证据[36]。与此相反，转导YFP-Claudin-3细胞的通透阻力从约550 Ohm×cm2降到了约400 Ohm×cm2[37-38]，因此，Claudin-3和Claudin-4对肺泡上皮的屏障功能有不同的影响。由于Claudin蛋白的相互作用改变了细胞旁通透性，所以Claudin蛋白的表达水平影响其自身的功能[37]。如增加Claudin-3的水平可以将犬肾传代上皮细胞的低抗噬菌体株的屏障功能从约50 Ohm×cm2提高到约100 Ohm×cm2，这一结果很有可能是Claudin-3与成孔Claudin蛋白Claudin-2相互协同促进作用的结果[38]，这与前面描述的Claudin-3阻碍上皮细胞屏障功能的结论正好相反[36]。从这个角度来讲，Claudin-3不同于Claudin-4只能和同型即Claudin-4蛋白相互作用，它可以和很多其他的Claudin蛋白发生异型相互作用[35,39]。Claudin-3和Claudin-4在指导紧密连接组装方面扮演不同角色，这是否会影响细胞旁通透性还有待进一步研究。然而，Claudin-3蛋白主要定位于肺泡的Ⅰ型-Ⅱ型细胞接口处，在细胞膜通透性中，Ⅰ型-Ⅱ型紧密连接与Ⅰ型-Ⅰ型细胞连接可能不同，其具体机制研究有待于体内测定肺泡紧密连接通透性方法的改进。

3小结

Claudin蛋白是细胞间紧密连接的主要功能蛋白，其通过细胞屏障、细胞旁路转运和信号转导维持细胞内环境的平衡。Claudin-4蛋白可有效增强肺泡上皮细胞的屏障作用，同时参与肺泡上皮细胞屏障重建过程，与很多肺上皮屏障功能缺陷相关疾病密切相关。对Claudin-4功能和调节机制的深入研究，可能为肺组织相关疾病(如急性肺损伤、气管炎、肺纤维化等)的临床诊断以及预后提供新的靶标。

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摘要：肺泡上皮直接与外界环境接触以进行气体交换，微小的上皮屏障的改变就可能增加肺部患某些疾病的敏感性。最近的研究已经把肺上皮屏障在肺相关疾病发生、发展中发挥的作用作为焦点(如急性肺损伤等)。尽管关于密封蛋白(Claudin)在肺部的功能及其调节机制还知之甚少，但越来越多的证据显示，急性肺损伤时外界环境的刺激会影响Claudin蛋白的表达以及肺泡上皮屏障功能。该文就急性肺损伤时Claudin蛋白调节肺泡上皮屏障功能的最新研究进展予以综述。

关键词：急性肺损伤；密封蛋白；紧密连接；肺泡上皮屏障

Role of Claudin Protein in Acute Lung InjuryLIUMei1,DENGXing-qi2，LIWen-fang1.(1.DepartmentofEmergencyMedicine,ShanghaiChangzhengHospital,Shanghai200003,China； 2.DepartmentofEmergencyMedicine，ShanghaiMinhangDistrictCentralHospital，Shanghai201101,China)

Abstract：Alveolar epithelium can have gas exchange by communicating with environment,so it is easy to be hurt by the environment.The slight change of epithelial barrier may bring the sensitvity of lung diseases.Recent studies have been focusing on the development of lung epithelial barrier in the lung diseases,such as acute lung injury.Although the underlying mechanisms of Claudin tight junction protein in lung diseases are still unclear,mounting evidences suggest that the expression of Claudin protein and the function of lung epithelial barrier can be influenced by the environment.Here is to make a review of the research progress in the function of Claudin protein regulating lung epithelial barrier in the acute lung injury.

Key words:Acute lung injury； Claudin protein; Tight junction; Lung epithelial barrier

收稿日期：2014-10-30修回日期：2015-02-27编辑：郑雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.15.008

中图分类号：R563

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)15-2709-04