基于H—NMR代谢组学技术的青翘抗炎活性部位筛选及作用机制研究

岳永花+何盼+孙迎娜+白关亚+郝旭亮+倪艳

[摘要]为筛选青翘抗炎的活性部位，明确作用机制，该研究给予雄性SD大鼠青翘水煎液、乙酸乙酯、正丁醇和剩余水层各部位提取物，连续15d，复制急性肺损伤炎症模型，观察肺组织切片结构，测试肺泡灌洗液的IL-6，TNF-a，IL-1，IL-10的水平，收集血清，采用H-NMR代谢组学技术分析大鼠血清内源性代谢产物的变化规律。结果显示青翘乙酸乙酯部位抗急性肺损伤炎症活性较好，能够抑制炎症因子IL-6，TNF-a，IL-1的释放，明显降低血清中肌酸、丁酸、琥珀酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺的含量，升高GPC的含量。该研究从体内代谢的角度进一步证明了乙酸乙酯部位是青翘抗炎的主要活性部位，主要通过调节肌酸代谢、胆碱代谢、支链氨基酸代谢以及三羧酸循环等通路发挥抗炎作用，可为青翘抗炎药效物质基础的研究奠定基础。

[关键词]青翘；急性肺损伤；抗炎；活性部位；代谢组学

连翘系木犀科植物连翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果实，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热之功效，大量研究证明连翘具有明显的抗炎作用，按照采收时间的不同，通常将连翘分为青翘和老翘，2015年版《中国药典》规定，青翘为秋季果实初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干而成；老翘则为果实熟透时采收，晒干，除去杂质而成。本课题组前期对青翘和老翘的药理作用进行了系统比较，发现青翘的抗炎作用优于老翘。

炎症模型根据发病原因可分为感染性炎症、非特异性炎症（包括小鼠耳肿胀、大鼠足跖肿胀、肉芽肿模型等）及变态反应性炎症。内毒素（即脂多糖LPS）通过吸入方式进入机体后诱导炎症介质和细胞因子的产生与释放，从而损伤肺泡上皮细胞及肺毛细血管内皮细胞，导致肺泡.毛细血管屏障通透性增加，最终造成感染后的急性肺损伤模型。曾有研究基于LPS诱导的人呼吸道上皮细胞炎癥模型对连翘提取物抗炎活性进行了研究，结果表明90%连翘酯苷A为连翘提取物抗炎的主要活性部位，活性成分为连翘酯苷A，从体外细胞实验证明了连翘对呼吸系统疾病的抗炎作用，但其在体内的抗炎活性部位及其作用机制尚无相关研究。

代谢组学是利用现代分析技术（如LC-MS，GC-MS，NMR）定量测定生物体的内源性代谢产物，考察生物体在不同状态（生理和病理）下代谢产物的动态变化，能反映机体调控过程的终点，从而表征特定环境下生物体的整体功能状态，具有整体性、动态性和系统性的特点，目前已广泛应用于中药活性部位、活性成分的筛选及药物作用机制等研究。本研究通过复制急性肺损伤炎症模型，从病理形态结构、炎症因子等传统药效学评价结果，结合代谢组学技术对青翘抗炎的活性部位进行筛选，并阐明作用机制，为连翘药效物质基础的研究提供科学依据。

1材料

1.1仪器

BioTek Synergy H1全功能微孔板检测仪（美国BioTek公司）；JWC-201D超声雾化器（鞍山市同信医用仪器厂）；KDC-2046低速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；Bruker 600 MHzAvanceⅢNMR Spectrometer（德国Bruker公司，600M核磁仪，600.13 MHz质子频率）；SIGMA 1-14高速离心机；石蜡包埋机（Histocentre 3，英国Shan.don）；石蜡切片机（Finesse 325，英国Shandon）；全自动组织脱水机（Excelsior，英国Shandon）；荧光显微成像系统（BX53，日本Olympus公司）。

1.2药品与试剂

内毒素（solarbio，批号818E035）；ELISA（IL-6，TNF-a，IL-1，IL-10）试剂盒（武汉博士德生物，批号EK0393）；正丁醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；石油醚30～60℃（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80，天津市申泰化学试剂有限公司）；重水（D：O，Sigma-aldrich，USA）。青翘饮片（山西产，批号20140703）购自亳州成源中药饮片有限公司，经山西省中医药研究院中药方剂所倪艳教授鉴定为青翘果实。

1.3实验动物

健康SD大鼠，雄性，体重（200±20）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）201343005，合格证号11804800001547。

1.4药物制备

取青翘饮片1kg，加10倍量水浸泡1h，煎煮1h，滤出药液，药渣加8倍量水煎煮30min，重复1次，合并3次药液，并减压浓缩至1.0 g·mL^-1。将浓缩至1.0g·mL^-1的青翘水煎液按1：1依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次，分出上层，合并各部位，回收溶剂，减压干燥，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及剩余水层的浸膏。由于石油醚萃取部位的浸膏量较小，因此未进行后续实验。将青翘水煎液和各部位提取物，按生药量4 g·kg^-1。（临床剂量的16倍）进行换算，加0.5%吐温80制成混悬液。

2方法

2.1模型复制及给药方法

健康SD大鼠60只，随机分为空白组、模型组、青翘水煎液组、乙酸乙酯组、正丁醇组和水层组，每组10只。青翘水煎液组、乙酸乙酯组、正丁醇组和水层组分别灌服生药量4 g·kg^-1的相应溶液，空白组和模型组大鼠灌服等量的生理盐水，连续15d。末次给药后，除空白组外，每组大鼠分别置于20mL20%内毒素溶液经超声波雾化器雾化的内毒素气体中30 mint。

2.2样本收集及指标检测

造模后4 h，20%乌拉坦麻醉后心脏取血，放置1 h，3 500 r·min。离心20min，取上清液，并分装，于一80℃保存，备用。结扎右肺中叶后于颈部正中切开暴露气管，并将气管上端结扎，插入磨圆的注射器针头，用5 mL生理盐水灌洗，通过气管插管慢慢注入气管内，反复抽吸几次，将洗液抽出，重复3次，最后得到2.5 mL洗液。将洗液放置1h后，3500r·min^-1离心20min，收集上清液。用ELISA试剂盒测定肺洗液中IL-6，TNF-a，IL-1和IL-10的含量，结果采用SPSS16.0软件进行t检验，以x±s表示。取结扎的右肺中叶部位，固定于10%甲醛溶液中，石蜡包埋，HE染色，做病理学检查。

2.3代谢组学分析

2.3.1样本处理血清样品解冻后，吸取450μL于1.5 mL EP管中，加入350μL D20，涡旋30s，离心（4℃，13 000 r·min^-1）20 min，取600μL上清液转移至核磁管（直径5 mm）中，待测。

2.3.2H-NMR测试条件

样品在Bruker 600MHz AVANCEⅢNMR仪（Bruker 5 mm BBO探头，600.13 MHz，298 K）测定。采用cpmgprld脉冲序列以衰减脂蛋白和蛋白质的宽单峰；扫描次数为64，谱宽为12019.2 Hz，图谱大小65 536数据点，脉冲时间14μs，傅里叶变换LB=0.3 Hz，弛豫时间1.0s。

2.3.3H-NMR图谱处理采用MestReNova（vet.sion 6.0.1，Mestrelab Research，Santiago de Compost-ella，Spain）核磁图谱处理软件对所有H-NMR图谱进行相位、基线调整，以肌酸（6 3.04）为标准对谱图进行化学位移的校正，对6 0.60～5.60区域的谱图进行6 0.01等宽度分割，水峰6 4.60～5.16区域以及麻醉剂信号4.13～4.18，1.31～1.33区域切除，其余区段积分。

2.3.4数据处理采用SIMCA-P 11.0（Umetrics，瑞典）软件对H-NMR采集处理的积分数据中心化和规格化后，进行主成分分析（principal componentanalysis，PCA），结果以PCA score plot表示，其中1个点代表1个样本（即1个代谢组），进一步用偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminantanalysis，PLS-DA）優化组间差异，以相应的VIP（var.iable importance in projection）值来寻找差异成分，VIP越大，表明该积分区间对应的化合物对分组贡献越大。采用SPSS 16.0软件中one-way ANOVA对差异代谢物进行显著性检验。

3结果

3.1病理学结果

空白组肺组织结构完整，肺泡腔清晰，腔内无渗出液体或炎症细胞，基本正常；模型组肺泡组织可见增宽，间隔内炎细胞浸润，间质中至重度充血，灶性肺泡内充满大量的红细胞，肺泡中至重度扩张；乙酸乙酯组间质轻度充血，轻度炎细胞浸润，肺泡轻至中度扩张；正丁醇组和水层组肺间质及肺泡内充满红细胞，间质炎细胞浸润，扩张严重的肺泡相互融合形成大的肺泡；水煎液组间质轻度增宽、充血，炎细胞轻度浸润。因此，与空白组相比，青翘乙酸乙酯提取物组肺组织损伤最小，其次为水煎液组，见图1。

3.2生化指标检测

与空白组相比，模型组肺洗液中IL-6，TNF-a，IL-1的含量显著升高（P<0.01），表明模型复制成功；与模型组相比，乙酸乙酯组IL-6，TNF-a，IL-1的水平均降低，差异有统计学意义（P<0.05）；正丁醇组只有TNF-a的含量明显低于模型组；水煎液组TNF-a，IL-1的含量明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；剩余水层各指标与模型组相比无显著性变化。各组之间IL-10的含量无明显差异，结果见表1，表明青翘乙酸乙酯组可以显著抑制炎症因子的释放，抗炎作用明显。

3.3H-NMR代谢组学分析

3.3.1大鼠血清H-NMR图谱归属

给予青翘水煎液、乙酸乙酯、正丁醇提取物后大鼠血清核磁图谱见图2，根据化学位移、峰形、耦合常数，结合文献[12.13]以及数据库the human metabolome database（HMDB，http：//www.hmdb.ca/），biological magneticresonance data bank（BMRB，http：//www.bmrb.wisc.edu/）对图谱进行指认，共鉴定24个化合物，包含氨基酸、有机酸、碳水化合物等，具体化学位移归属见表2。

3.3.2多元统计分析直观分析图谱，较难发现各组间差异，因此借助多元统计分析，全面对比图谱。对空白组、模型组、青翘水煎液组、乙酸乙酯部位和正丁醇部位大鼠血清核磁图谱进行PLS-DA分析，评价PLS-DA模型常用排列实验判定有效性，2条回归线斜率越大，左端任何一次随机排列产生的小于右端，且最右端的2个值差距较小，证明模型有效。5组样本整体分布得分图和模型验证见图3，表明吸入内毒素和给予青翘提取物后，大鼠血清内源性代谢物发生了变化；空白组、水煎液组、乙酸乙酯部位与正丁醇组、模型组基本沿t轴分开，水煎液和乙酸乙酯部位对吸入内毒素的炎症模型大鼠有向空白组调节的趋势，且乙酸乙酯组更接近空白组，而正丁醇部位作用不明显，表明青翘乙酸乙酯部位的抗炎活性最佳，可能是该部位有效富集了青翘的抗炎活性成分。

模型组分别与空白组、各给药组进行PLS-DA分析，结果见图4。空白组与模型组能明显分开且模型验证成立，表明吸人内毒素的急性肺损伤炎症模型复制成功。青翘水煎液组、乙酸乙酯组与模型组对比，均能明显分开且模型有效、可靠；而正丁醇组与模型组PLS-DA模型验证不成立，表明青翘水煎液组和乙酸乙酯组可以调节炎症模型大鼠血清内源性代谢产物，发挥了抗炎作用。

模型组血清与空白组相比，以VIP值大于1确定了13个差异代谢物，肌酸、丁酸、琥珀酸、赖氨酸、缬氨酸、葡萄糖、异亮氨酸、谷氨酰胺和TMA0含量升高，而丙氨酸、丙酮酸、GPC和PC含量降低，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。差异代谢物在各组中的含量分布见图5，与模型组相比，青翘水煎液组显著调节6个代谢物，肌酸、丁酸、琥珀酸、葡萄糖和TMAO的含量降低，GPC含量升高（P<0.05）；乙酸乙酯组显著调节B个代谢物，肌酸、丁酸、琥珀酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和谷氨酰胺的含量降低，GPC含量升高（P<0.05）；正丁醇组对差异代谢物的调节不显著；各给药组对丙氨酸、丙酮酸和PC含量的调节均无显著性变化；进一步证明了青翘乙酸乙酯部位具有明显的抗炎作用。

4讨论

国内外研究表明内毒素致急性肺损伤模型的特点为：血液、肺支气管灌洗液中炎症因子水平升高及相关酶活性发生变化；肺血管壁通透性升高；肺组织病理切片上会有轻度肺水肿的现象。LPS进入血液与相应受体结合激活单核.巨噬细胞等免疫细胞，诱发机体释放各种细胞因子，这些细胞因子可分为：①介导组织损伤的促炎细胞因子，如TNF-a，IL.6，IL-1等；②抗炎细胞因子，如IL-4，IL-10等。本研究主要考察了肺泡灌洗液中TNF-a，IL-6，IL-1和IL-10的水平，结果表明乙酸乙酯部位能够明显降低IL-6，TNF-a和IL-1/～的水平，水煎液组可以明显降低TNF-a和IL-1，正丁醇部位仅能使TNF-a的水平明显降低，剩余水层对各指标的调节不明显。各组之间IL-10的含量无明显变化，模型组IL-6，TNF-a，IL-1和IL-10的含量高于空白组，说明内毒素导致急性肺损伤炎症过程中促炎症反应和抗炎症反应同时存在，青翘发挥抗炎作用主要是通过抑制促炎症细胞因子的释放。

本研究进一步对空白组、模型组、青翘水煎液组、乙酸乙酯组和正丁醇组大鼠血清进行核磁共振代谢组学分析，共指认24个代谢物，通过模式识别寻找到13个差异代谢物。为了明确青翘减轻急性肺损伤炎症所涉及的代谢通路，本研究参考KEGG数据库对发现的差异代谢物进行生物学意义阐释。

肌酸作为一种营养增补剂，能辅助为肌肉和神经供能，是由甘氨酸、精氨酸和甲硫氨酸合成，可以经肝脏和肾脏自行合成，也可以从食物中摄取。有研究表明补充肌酸可以减轻慢性阻塞性肺病和囊性纤维化，但其却能明显加重过敏性肺病炎症。本实验中吸入内毒素炎症模型组肌酸含量较高，而给药后含量降低，表明青翘可以抑制由内毒素诱导的过敏炎症反应，从而发挥减轻肺损伤炎症作用。

甘油磷酸胆碱（GPC）是机体内磷脂代谢的产物之一，也是重要的神经传递介质乙酰胆碱的生物合成前体。GPC合成磷脂酰胆碱，后者为细胞膜的重要组成部分；神经递质乙酰胆碱组成胆碱能抗炎通路（CAP），该通路激活后可以抑制LPS诱导的NF.KB信号途径活化，从而使炎症因子表达下降。本研究水煎液组和乙酸乙酯组的GPC含量高于模型组，提示青翘一方面能够保护肺泡细胞膜的结构，另一方面可以促进乙酰胆碱的释放，激活CAP，抑制炎症反应。

缬氨酸、异亮氨酸为9种必需氨基酸中2种，属于支链氨基酸，二者作为生糖氨基酸，通过转氨基作用生成琥珀酰辅酶A，后者为三羧酸循环（TCA）中很重要的一个酶，其在琥珀酸硫激酶的作用下生成琥珀酸。Nature杂志上已有研究报道，LPS增加了TCA循环中琥珀酸的水平，琥珀酸是先天免疫信号的代谢物，在炎症发生时可以通过转录因子HIF-1提高IL-1的产量。本实验中模型组缬氨酸、异亮氨酸含量较高，引起葡萄糖和琥珀酸水平也相对较高。青翘水煎液和乙酸乙酯提取物能显著降低琥珀酸含量，使IL-1的表达减少，从而抑制炎症发生。

谷氨酰胺体内脱氨生成谷氨酸，后者在谷氨酸脱氢酶的作用下生成酮戊二酸，进入三羧酸循环，生成ATP，保证机体能量供给。谷氨酰胺已被报道可以抑制NF.KB活化，衰减炎症细胞因子的释放。本研究中谷氨酰胺含量给药组低于模型组，可能是由于给药组能量代谢高于模型组，使得其含量降低，具体原因还有待于进一步分析。

氧化三甲胺（TMAO）的变化反映肠道菌群的紊乱，已有研究表明肺是一个重要的免疫器官，若肺部的炎性损伤未能及时控制，便可成为炎性介质的发源地，加重全身性炎症反应。肠道菌群紊乱提示肺部炎症连带机体其他不良反应的发生，青翘水煎液组的抗炎作用可以抑制肠道菌群紊乱。

青翘主要通过调节肌酸、甘油磷酸胆碱、琥珀酸和氧化三甲胺4个主要的生物标志物来发挥抗炎作用，其余代谢物参与的通路有待进一步分析。水煎液组可以显著调节6个血清内源性代谢物，参与的代谢通路有肌酸代谢、胆碱代谢、三羧酸循环以及肠道菌群代谢，而乙酸乙酯部位共調节8个，参与的代谢通路有肌酸代谢、胆碱代谢、支链氨基酸代谢以及三羧酸循环，二者调节的代谢物部分不同，说明作用靶点存在差异。本研究采用代谢组学技术从机体内源性代谢物整体变化的角度进一步证明了乙酸乙酯部位是青翘抗炎的主要活性部位，并阐明了相应的作用机制。