HAC1基因过表达对重组人CTLA－4蛋白在毕赤酵母中分泌表达的影响

何秋焱，杨 艳，朱乃硕

（复旦大学 生命科学学院 微生物学与微生物工程系，上海 200438）

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是目前最具应用前景的表达宿主.它既具有原核生物增殖速度快，易于培养，便于基因工程操作和适于高密度发酵等特性［1］；同时作为一种真核生物，其细胞内环境和糖链加工系统可以进行翻译后的蛋白加工，以使外源蛋白得到正确的折叠和修饰［2］.但随着对大量不同外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达的研究发现，并不是所有蛋白质均能在该宿主中高效地分泌表达，这严重限制了毕赤酵母这一表达系统的推广应用［3］.

通过采用不同的启动子或者增加外源基因拷贝数的方法虽然可以提高外源蛋白在毕赤酵母细胞内的表达量［4－7］，但在胞内大量表达的外源蛋白常常由于无法及时折叠、加工而聚集在内质网中无法分泌到胞外［8－9］，影响外源蛋白的分泌表达水平.滞留在细胞内未正确折叠的蛋白质会对内质网造成胁迫，作为一种防御机制，受到未折叠蛋白胁迫的细胞会产生未折叠蛋白反应（UPR）.UPR 信号通路调控的下游基因可以通过激活内质网中参与蛋白折叠加工等酶类的基因转录，增强内质网处理未折叠蛋白的能力［10］.目前发现酵母中UPR 的信号途径主要是内质网转膜蛋白激酶1（Inositol－Requiring Enzyme 1，IRE1）调控的转录激活因子（Activating Transcript Factor，ATF）／环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP－Response Element Binding protein，CREB）家族同源物（homologous to the ATF／CREB 1，HAC1）途径［11］，因此通过过表达HAC1基因来提高外源基因在毕赤酵母细胞中分泌表达水平［11－14］已成为近年来的研究热点.

细胞毒性T 细胞相关抗原（Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen 4，CTLA－4）是体内重要的免疫负调控因子，它可与CD28竞争跟B7分子的结合，抑制T 细胞的活化，对T 细胞过度活化相关的疾病有显著的治疗及预防作用，在抗器官移植排斥和治疗自身免疫病等方面有广阔的应用前景.本研究小组已成功克隆中国人CTLA－4 胞外区基因（GenBank 登录号：AF316875）［15］，并且构建出毕赤酵母CTLA－4分泌表达载体，获得了有生物活性的重组人CTLA－4胞外区蛋白［16］.为了提高该蛋白的表达量，我们借助毕赤酵母的UPR 信号途径，通过共表达HAC1蛋白的方法以实现重组人CTLA－4胞外蛋白在毕赤酵母中的高效分泌表达.

1 材料和方法

1.1 主要试剂

大肠杆菌E.coli DH5α 菌株，毕赤酵母GS115 菌株，pPIC9K 空载体为本实验室所保存.克隆有CTLA－4胞外区基因的pPICZα质粒（pPICZα－CTLA－4）及克隆有毕赤酵母GAPDH 基因的pMD19－T 载体质粒（T－GAPDH）为本室所构建保存.抗生素Zeocine及RNA 提取所用TRIzol试剂购自Invitrogen公司.逆转录所用试剂盒以及克隆所用PrimerSTAR HS DNA 聚合酶，T4DNA 连接酶和EcoRⅠ，SalⅠ，BamHⅠ，XhoⅠ等限制性内切酶均购自TaKaRa公司.酵母基因组DNA 快速提取试剂盒购自Bioteck公司.荧光定量PCR 预混液（SYBER Green）购自TOYOBO 公司.兔抗人CTLA－4 单抗，HRP－羊抗兔IgG 二抗均购自Santa Cruz公司.Ni－NTA 亲和纯化柱（5mL）购自GE 公司.其余氯化钠、磷酸二氢钾等常规试剂均来源于国药.CTLA－4 标准蛋白由本实验室表达纯化和保藏.本实验中所用引物均有Invitrogen合成，引物设计见表1.

表1 本文用到的引物Tab.1 Primers used in this paper

1.2 方法

1.2.1 pPICZα－CTLA－4质粒高拷贝转化子的筛选

经酶切和测序验证的pPICZα－CTLA－4质粒大量扩增后用BamHⅠ酶切线性化，线性化的质粒通过电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞.转化子经0.2～2mg／mL Zeocine梯度筛选获得多拷贝插入的阳性表达菌株，并将CTLA－4 基因高拷贝GS115 菌株命名M－CTLA－4.CTLA－4 基因起始模板拷贝数与GAPDH 基因起始模板拷贝数的比值即为CTLA－4基因在毕赤酵母基因组中的拷贝数.

1.2.2 HAC1蛋白编码基因的克隆、转化及高拷贝转化子的筛选

将毕赤酵母GS115菌株接种至YPD 液体培养基，30℃摇床过夜培养至对数生长期后，向培养液中加入灭菌的DDT 溶液使培养液中DDT 终浓度为5mmol／L，再将培养液放入30℃摇床诱导1h.经DDT诱导后的酵母细胞中会累积大量未折叠蛋白，引起细胞产生未折叠蛋白反应，大量生成编码HAC1蛋白的mRNA.收集经DDT 诱导后的酵母细胞，提取细胞总RNA，并反转录获得细胞的cDNA.以该cDNA为模板、HAC1－U1／HAC1－D1为引物大量扩增HAC1蛋白的编码基因，酶切后连接入pPIC9K 载体，挑取阳性克隆测序验证（DNA 测序由Invitrogen公司完成），测序正确的质粒命名为pPIC9k－HAC1.将测序正确的pPIC9K－HAC1质粒大量扩增后用SacⅠ酶切线性化，线性化的质粒通过电转化至1.2中获得的CTLA－4基因高拷贝菌株M－CTLA－4，转化子经0.5～3mg／mL G418梯度筛选获得多拷贝插入的阳性表达菌落，并将高拷贝菌株命名为M－HAC1.

1.2.3 高拷贝菌株M－HAC1中HAC1基因拷贝数和转录水平的检测

1.2.3.1 实时荧光定量PCR 标准曲线的建立

测序正确的T－GAPDH 质粒用微量核酸定量仪测定浓度，计算出每微升质粒溶液中所含质粒的拷贝数.将质粒溶液按10倍梯度稀释成5个不同浓度，分别以2μL不同浓度质粒溶液作为模板，以GAPDH－U／GAPDH－D为引物进行荧光定量PCR.反应条件见表2.每个样品重复检测3次，每次设置3个平行反应，即进行3次独立的质粒抽提、浓度检测、稀释及荧光定量PCR过程.同样的方法建立HAC1标准曲线.

1.2.3.2 高拷贝菌株M－HAC1基因组中HAC1基因拷贝数的检测

提取高拷贝转化子的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，分别以GAPDH－U／GAPDH－D，HAC1－U2／HAC1－D2为引物进行荧光定量PCR，反应条件见表2.每个样品重复检测3次，每次设置3个平行反应，即进行3次独立基因组DNA 抽提和荧光定量PCR 过程.将得到的Ct 值分别代入标准曲线中，求出DNA 样品中GAPDH 基因和HAC1 基因的起始模板拷贝数.GAPDH 基因在毕赤酵母的基因组中以单拷贝的形式存在［17］，因此用GAPDH 基因的拷贝数可以表征模板中基因组的起始拷贝数.

1.2.3.3 高拷贝菌株M－HAC1中HAC1基因转录水平的检测

将高拷贝毕赤酵母M－HAC1和M－CTLA－4菌株分别接种至YPD 液体培养基，30℃摇床过夜培养至对数生长期后离心收集酵母细胞，分别提取细胞总RNA，总RNA 溶液经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定纯度，反转录获得细胞的cDNA.以该cDNA 为模板，以GAPDH－U／GAPDH－D 和HAC1－U2／HAC1－D2为引物分别以进行实时荧光定量PCR 检测，反应条件见表2.

1.2.4 重组人CTLA－4蛋白的诱导表达和检测

将筛选到的高拷贝转化子接种至BMGY 培养基中扩大培养，培养液离心去上清得到的菌体用无菌水清洗3次后转接至等体积BMMY 培养基诱导表达，每隔24h补加2%体积的甲醇，72h后诱导结束.将诱导培养液在4℃条件下离心收集上清液，上清液直接进行SDS－PAGE、Western blot检测.并将SDSPAGE胶中诱导表达蛋白条带用胰蛋白酶消化后进行质谱鉴定.

表2 RT－qPCR 的反应条件Tab.2 The reaction conditions of RT－qPCR

2 结果

2.1 重组人CTLA－4蛋白的表达鉴定

经抗生素梯度筛选获得高拷贝菌株M－CTLA－4，利用RT－PCR 的方法测定CTLA－4基因在该菌株基因组中的拷贝数为6.将该菌株进行小量摇瓶发酵，诱导重组人DaCTLA－4蛋白表达，低温离心收集发酵上清液.上清液直接进行15%SDS－PAGE 电泳和银染显色和Western blot检测.银染结果显示，在21kDa的理论分子量处（17～25 kDa之间）有明显蛋白条带（图1），使用兔抗人CTLA－4单抗和HRP－羊抗兔IgG 二抗进行Western blot分析，证明该蛋白能与兔抗人CTLA－4抗体特异性结合（图2）.

取少量发酵上清液，将亲和层析柱进行纯化后的产物进行SDS－PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，将目的蛋白条带切下后用胰蛋白酶消化并进行质谱鉴定，数据库比对后结果显示该蛋白确为重组人CTLA－4蛋白（score 96）（表3）.

图1 M－CTLA－4菌株发酵上清液的SDS－PAGE分析Fig.1 SDS－PAGE of M－CTLA－4 fermentation supernate

2.2 HAC1基因的克隆

HAC1基因的mRNA 在毕赤酵母细胞中是一直存在的，但只有在细胞发生未折叠蛋白反应的情况下，HAC1基因的mRNA 才会被加工剪切成为无内含子mRNA，并翻译出有功能的HAC1 蛋白.因此以诱导UPR 反应后的毕赤酵母细胞总cDNA 为模板进行PCR 扩增即可得到不含内含子的HAC1编码基因，经琼脂糖电泳检测条带大小与预期相符（图3）.将扩增到的HAC1 基因片段，切胶纯化并定量后，构建到pPIC9k 载体，然后转化E.coli DH5α 感受态菌.转化子用PCR 鉴定，可见在预期的1 000bp左右有特异性扩增条带（图4），证明HAC1基因已经成功克隆至E.coli DH5α中.挑选PCR 鉴定阳性克隆，进行测序验证插入序列无误.

图2 Western blot鉴定发酵上清中的CTLA－4蛋白Fig.2 Western blot detection of CTLA－4 in the fermentation supernate

表3 CTLA－4质谱肽段数据库比对结果Tab.3 Mass spectrometric analysis of CTLA－4peptide

图3 HAC1基因的PCR 扩增Fig.3 PCR prouduct of HAC1gene

图4 HAC1基因原核表达载体阳性转化子的PCR 鉴定Fig.4 Identification of the expression vetctor for HAC1gene

2.3 HAC1基因在毕赤酵母基因组中拷贝数的检测

本文采用的是双标准曲线实时荧光定量PCR 的方法［18］来测定毕赤酵母中外源基因拷贝数.GAPDH 和HAC1基因的标准曲线由RT－PCR仪Stratagene Mx3000P自带系统软件分析获得，分别为：y＝－3.313x＋32.86（R＝0.998），y＝－3.453x＋34.05（R＝0.998），GAPDH 基因标准曲线Ct 值的标准偏差（SD）为0.01～0.18，变异系数（CV）为0.06～0.67，HAC1 基因标准曲线Ct值的标准偏差为0.03～0.12，变异系数为0.02～0.51，证明建立的标准曲线重复性良好（表4）.

将1.4.2 中获得的Ct 值带入标准曲线方程，结果见表5（第782 页）.我们可以看到，在未转化pPIC9k－HAC1质粒的M－CTLA－4菌株的基因组中HAC1基因的拷贝数为1，说明HAC1基因本身就存在于毕赤酵母细胞基因组中，且拷贝数为1；而转化了pPIC9k－HAC1质粒的M－HAC1菌株的基因组中HAC1基因拷贝数为3.我们希望通过HAC1基因的高拷贝来获得HAC1蛋白的高表达，从而增强毕赤酵母对未折叠蛋白的处理能力.

表4 标准曲线重复性Tab.4 Reproducibility of standard curves

表5 实时荧光定量PCR 检测GAPDH 和HAC1基因在毕赤酵母基因组中的拷贝数Tab.5 Copy numbers of GAPDH and HAC1gene in P.pastoris detected by real－time fluorescent quantitative PCR

2.4 HAC1基因表达量在转录水平上的检测

HAC1蛋白在毕赤酵母中的表达量很低，且没有相应的抗体可以进行检测，因此我们通过HAC1基因的转录水平来表征HAC1蛋白的表达水平.实时荧光定量PCR 显示在M－CTLA－4和M－HAC1两个菌株中均检测到有HAC1基因mRNA 的表达.不同模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，达到相对定量的目的（双标准曲线法［19］）.GAPDH 和HAC1基因的标准曲线由RT－PCR 仪Stratagene Mx3000P自带系统软件分析获得，分别为：y＝－3.086x＋37.77（R＝0.988），y＝－3.057x＋37.81（R＝0.987），GAPDH基因标准曲线Ct值的标准偏差（SD）为0.03～0.14，变异系数（CV）为0.09～0.75，HAC1基因标准曲线Ct值的标准偏差为0.03～0.12，变异系数为0.10～0.79，证明建立的标准曲线重复性良好（表6）.

表6 标准曲线重复性Tab.6 Reproducibility of standard curves

M－CTLA－4 和M－HAC1 菌株中HAC1 基因的相对表达量的值等于该基因表达量的均值除以GAPDH 基因表达量的均值.M－HAC1菌株中HAC1基因相对GAPDH 基因的表达量为27.34%，MCTLA－4菌株中HAC1基因相对GAPDH 基因的表达量为9.65%.由此可知，M－HAC1菌株中HAC1基因的表达量约为M－CTLA－4基因的2.83倍，与该基因在两菌株基因组中的拷贝数成正比关系.

2.5 过表达HAC1对重组人CTLA－4蛋白分泌表达水平的影响

如图5所示，M－HAC1菌株发酵分泌表达的重组人CTLA－4蛋白条带明显要比M－CTLA－4菌株的条带染色更深，说明过表达HAC1基因的确可以提高M－HAC1菌株分泌表达重组人CTLA－4蛋白的水平.使用凝胶扫描系统以CTLA－4蛋白标准溶液对照条带为基准值1.0对不同毕赤酵母菌株的染色条带进行分析比较可知（图6），M－HAC1菌株分泌表达重组人CTLA－4蛋白的水平约为M－CTLA－4菌株的2.55（（9.133－0.599／（3.95－0.599）＝2.55）倍.

图5 M－CTLA－4菌株及M－HAC1菌株中CTLA－4表达的SDS－PAGE分析Fig.5 SDS－PAGE of CTLA－4protein in M－CTLA－4＆ M－HAC1

图6 凝胶扫描分析结果Fig.6 Results of gel scanning

3 讨论

共刺激信号是T 淋巴细胞活化过程中不可或缺的重要激活因子.CTLA－4作为一个天然的共刺激信号负调控分子，能有效而又特异性的抑制病理性T 淋巴细胞活化，目前已被开发制成药物，例如阿巴西普（Abatacept）和贝拉西普（Belatacept）［20－21］，并获得了美国和欧盟的批准上市，用于治疗中度至重度活动性类风湿性关节炎.但由于该蛋白表达水平低，生产成本高，价格昂贵，英国国家卫生与临床优化研究所鉴于药物经济学的分析结果，拒绝了阿巴西普用于重症类风湿性关节炎的申请.所以，要想将CTLA－4蛋白作为一种免疫抑制药物广泛地应用于临床治疗，提高表达量、降低成本是一个亟待解决的问题.

基因工程蛋白高表达的策略主要有：表达系统的优化、表达载体的优化、启动子的选择、密码子的优化、基因剂量效应以及与高表达基因融合表达等方法.本研究室自成功克隆了中国人的CTLA－4基因以来，尝试了多种方法提高改蛋白的表达水平，但结果并不理想.近期有大量研究表明，酵母细胞的内质网处理初生多肽的能力是有限的，影响外源蛋白在酵母细胞中分泌表达的关键步骤是初生多肽链在内质网中的折叠、加工以及囊泡运输等过程.HAC1蛋白是毕赤酵母中一个转录因子，它可以调控折叠酶、分子伴侣等蛋白的表达，从而影响外源蛋白的分泌表达水平.但该蛋白仅在毕赤酵母细胞产生UPR 反应后才会表达，且表达水平很低.本文克隆了毕赤酵母HAC1蛋白的编码基因，在整合有CTLA－4基因的毕赤酵母细胞中过表达HAC1基因，从而改善了CTLA－4蛋白在毕赤酵母细胞中的分泌表达水平，效果比较明显，将CTLA－4蛋白广泛应用于临床治疗的进程往前推进了一大步.

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