拟南芥染色质重塑因子编码基因INO80新的可变剪切转录本

安增选，朱 炎

（1.复旦大学 生命科学学院 植物科学研究所，上海 200438；2.复旦大学 遗传工程国家重点实验室，上海 200438）

转录本的剪切和蛋白质翻译对于多细胞真核生物的生长发育以及应对外界环境变化是至关重要的［1］.基因表达的重要步骤之一是通过剪切将前体mRNA 中的内含子去除.可变剪切（Alternative Splicing，AS）通过对不同剪切位点的选择，使得一个前体mRNA 产生多种mRNA.人类中，超过95%含有内含子的基因会发生可变剪切，大约15%的遗传疾病与影响剪切或者可变剪切的突变有关［2］；植物中超过60%的基因会发生可变剪切，大部分剪切变体的功能是未知的［1］.

最早报道植物可变剪切的实例是富含丝氨酸／精氨酸的可变剪切因子AtRSp31在不同器官和不同生长阶段的表达发生了改变，暗示植物可变剪切的器官特异性［3－5］.另外一个植物中典型的可变剪切案例是水稻中编码影响谷粒直链淀粉含量的谷粒结合淀粉合成酶Waxy 基因，其相应的突变体在5’端第一个内含子处有一个鸟苷到尿苷的突变，会降低可变剪切的效率，从而产生低淀粉含量的谷粒［6－8］.Kriechbaumer等发现一个生长素合成酶基因YUCCA4，其可变剪切改变了亚细胞定位.广泛表达的YUCCA4是定位在细胞质中，而花器官中特异表达的另一转录本则是定位在内质网中［9］，暗示了可变剪切的器官特异性.剪切因子和剪切体蛋白能够影响细胞命运、生物钟、植物防御和对非生物胁迫的耐受性.对剪切因子和剪切体蛋白突变体的筛选也表明了可变剪切在植物生长、发育和应对外界环境方面有着重要的功能［10］.

染色质重塑因子（chromatin remodeling factor）是一类利用水解ATP的能量介导核小体滑动、移除或者组蛋白变体置换从而改变核小体状态的蛋白质.目前已经发现4类染色质重塑因子，分别是SWI／SNF家族，ISWI家族，CHD 家族和INO80家族，它们都含有一个相似的ATPase结构域［11］.INO80家族的结构特点是其ATPase结构域被一段多于300 个氨基酸的插入序列分隔开，形成两个相对独立的HELICASE＿ATP＿BIND＿1结构域和HELICASE＿CTER 结构域.INO80家族包含两个重要的成员，分别是INO80和SWR1［12］.

酵母中INO80与不同亚基结合形成含有15个成员的复合物，称为INO80复合物.在人类和拟南芥（Arabidopsis thaliana，At）中保守.INO80基因最早是由Ebbert等人在筛选肌醇应答缺陷型酿酒酵母时发现［13］.随后Wu实验室纯化了酵母的INO80复合物，体外实验发现INO80复合物具有DNA 依赖的ATP酶活性和3’－5’的解旋酶活性［14］.INO80复合物能够在体外结合自由的DNA，并且有与SWI／SNF类似的明显的结合常数（～10nmol／L），能够以一种ATP 依赖的方式移动单核小体［15］.哺乳动物中INO80倾向于结合类似于Holiday junction的四链DNA 和类似于复制叉的三链DNA［16］.Peterson等通过体外实验证明了酵母INO80能够催化H2A.Z的移除，并能够调控H2A.Z的全局性分布［17］.

INO80在体内发挥着重要的生物学功能，在酵母中的报道较多.酵母的芯片数据表明，20%的基因受到INO80复合体的正调控或者负调控［18－20］.酵母中INO80突变体对基因毒试剂和核酸内切酶HO 引发的双链断裂（DSB）敏感，并且不能将DSB 转变为ssDNA，INO80 通过与γ－H2AX 相互作用并依赖于Nhp10直接招募到HO 引发的DSB 位点，暗示INO80可以在DSB 位点处发挥直接功能［20－21］.酵母中INO80在复制起始位点处出现，并且在羟基脲（Hydroxyureal，HU）引发的复制叉停滞时有更明显的富集，能够改变复制胁迫应答［22－23］.此外缺失INO80复合物成员的突变体降低了端粒的延长，可以导致两条染色体的端粒末端融合［24］.

目前植物中有关INO80的报道仅有一篇.拟南芥缺失INO80并不影响植物的生长发育，但会导致体细胞同源重组频率的下降［25］.我们实验室在2012年报道了H2A－H2B 组蛋白分子伴侣NAP1家族蛋白参与体细胞同源重组［26］.有意思的是，NAP1蛋白的缺失同样不影响植物的生长发育［27］.鉴于INO80在植物发育和体细胞同源重组上和NAP1有着相似的表型，我们希望对拟南芥中INO80的功能进行深入的研究.在克隆拟南芥INO80（AtINO80）的cDNA 时，我们意外发现了一个新的INO80可变剪切形式，在不同器官的表达量不同，并且在各种基因毒试剂处理下其转录水平也发生了改变.我们对这种可变剪切产生的蛋白进行了初步的结构分析，对其功能进行了初步探讨.

1 材料与方法

1.1 材料

拟南芥Arabidopsis thaliana Col－0种子；大肠杆菌菌株Escherichia coli Top10，Rosetta DE3；农杆菌转化菌株Agrobacterium tumefaciens GV3101；原核表达载体pGEX－4T－1；农杆菌转化载体pCAMBIA1300；以上材料均为本实验室保存.

植物培养土成分：黑土40%，蛭石40%，珍珠岩20%；植物MS 培养基：MS－0255 4.9g／L，蔗糖10g／L，KOH 调pH 至5.7，固体培养基含琼脂粉0.9%，灭菌条件118℃，30min，选择培养基含潮霉素25μ／mL，灭菌后温度降至50℃左右添加.植物培养条件22℃，光照16h，黑暗8h，相对湿度80%.

大肠杆菌LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，选择培养基含100μg／mL 氨苄霉素或50μg／mL卡那霉素.农杆菌YEB培养基：蔗糖0.5%，牛肉提取物0.5%，酵母提取物0.1%，蛋白胨0.5%，MgSO42mol／L，KOH 调pH 至7.2，选择培养基含25μg／mL 利福平、50μg／mL 卡那霉素.以上培养基灭菌条件均为118 ℃，30 min.选择培养基成分灭菌后添加.大肠杆菌培养条件37 ℃，220r／min，农杆菌培养条件28℃，220r／min，避光.

RNA 提取试剂TRIzol购自Ambion公司；反转录试剂盒购自Promega公司；DNA 限制性内切酶、T4DNA 连接酶、rTaq酶等购自TaKaRa公司；高保真KOD 酶购自Toyobo公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Axygen公司；MS－0255购自Duchefa Biochemie公司，胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉提取物等购自Sigma公司；克隆构建载体pMD 19（T 载体）购自TaKaRa.其他常规试剂采用分析纯.

引物合成及克隆测序均由上海桑尼生物科技有限公司完成.

1.2 方法

1.2.1 AtINO80基因全长及蛋白序列的获得和蛋白序列分析

AtINO80基因全长及蛋白序列下载自Tair网站（www.arabidopsis.org），蛋白序列结构域分析通过ExPASy网站（http：∥www.expasy.org／）完成，蛋白序列比对由DNAStar MegAlign软件完成.

1.2.2 拟南芥RNA 提取及实时荧光定量PCR 分析拟南芥各个组织器官：幼苗及根取自在MS固体培养平板上生长12d的材料，莲座叶取自在土壤中生长20d左右的材料，茎、茎生叶、花及花序取自在土壤中生长30d左右的材料，果荚取自在土壤中生长40d左右的材料.试剂处理拟南芥：拟南芥在MS固体培养平板上生长12d后，分别移至含有90mg／L甲基甲烷磺酸盐（Methl Methanesulphonate，MMS），2mmol／L 羟基脲（Hydroxyureal，HU），2μmol／L博来霉素（Bleomycin，BLM），2μmol／L脱落酸（Abscisic Acid，ABA），150mmol／L NaCl的液体MS培养基中处理6h取样，或者37℃处理2h 取样，或者紫外交联仪（中西，CL－1000）处理，剂量3 750J／m2，恢复培养2h后取样.RNA 提取按照TRIzol试剂盒步骤操作，反转录按照Promega试剂盒操作，采用实时荧光定量PCR 仪（BIO－RAD，CFX96）检测各个植物材料中AtINO80 全长和可变剪切表达量，未处理材料作为对照.引物序列见表1.

1.2.3 原核表达与纯化GST－INO80－Z结构域

INO80－Z结构域通过EcoRⅠ和SalⅠ克隆至载体pGEX－4T－1.转化至E.coli Rosetta DE3，扩大培养后离心收集菌体，1×PBS 重悬后再次离心，用裂解液（1×PBS，0.1% Triton X－100，10% 甘油，1mmol／L二硫苏糖醇，1mg／mL溶菌酶，1mmol／L蛋白酶抑制剂）再次重悬，超声波破碎，高速离心后取上清，与GSH 珠子4℃孵育3h，用清洗液（1×PBS，10% 甘油，1mmol／L二硫苏糖醇，1mmol／L蛋白酶抑制剂）清洗珠子3次，用SDS－PAGE胶检测纯化结果.

1.2.4 pull－down检测INO80－Z结构域与H2A.Z－H2B结合

将纯化后带有GST－INO80－Z 结构域的珠子用结合液（1×PBS，0.2% NP－40，10 mg／mL BSA，1mmol／L蛋白酶抑制剂）4 ℃孵育1h 后，低速离心去上清，与H2A.Z－H2B4 ℃孵育4h，清洗液（20mmol／L Tris－Cl pH8.0，0.5mol／L NaCl，0.5% NP－40，1mmol／L 蛋白酶抑制剂）清洗珠子4次，对照采用带有GST 蛋白的珠子，用SDS－PAGE胶检测结合结果.

1.2.5 植物转基因及Western blot检测

克隆构建策略，分别将INO80启动子序列，YFP 序列，INO80全长基因组序列克隆到T 载体上，再酶切连接到pCAMBIA1300.转化到农杆菌GV3101，使用蘸花法转化到植物中.用含潮霉素25μg／mL的MS培养板进行转化株筛选.分别取阳性株的花序，莲座叶，幼苗，液氮研磨后，分别取100μL 加入100μL 2×SDS上样缓冲液，95℃处理后离心，利用商品化抗体GFP（Abmart）进行Western blot检测.

表1 基因表达水平检测引物Tab.1 Primers for testing gene transcription level

2 结果

2.1 AtINO80一个新的可变剪切转录本At3G57300.3

在Tair网站（www.arabidopsis.org）上调取了AtINO80的序列，显示AtINO80全长有8 398bp（包含UTR），共有两种剪切模式，分别命名为At3G57300.1和At3G57300.2，其中At3G57300.2是主要的剪切模式（图1（a））.与At3G57300.1相比，At3G57300.2在3 357～3 891bp位置剪切发生了改变，多了一段不移码的99bp.在ExPASy网站上对AtINO80蛋白序列进行了结构域分析.结果显示（图1（c））全长INO80 共含有3个结构域，分别为DBINO 结构域，HELICASE＿ATP＿BIND＿1 结构域和HELICASE＿CTER 结构域.At3G57300.2 的翻译产物多了33个氨基酸，位于HELICASE＿ATP＿BIND＿1结构域.

在克隆AtINO80cDNA 序列的过程中，我们意外获得了一个新的序列，命名为At3G57300.3.与已有的两个序列不同的是，At3G57300.3在5 139～5 299bp位置处的内含子变成了外显子，CDS的大小由4 623bp（At3G57300.2）变成了4 784bp（图1（b））.对At3G57300.3的核苷酸序列分析，发现这一转录本在2 755bp处提前产生了一个终止密码子UAG（图1（b）），使得AtINO80蛋白全长的大小由1 540个氨基酸变成了918个氨基酸，预测蛋白大小由169.4kDa减至100.98kDa.

AT3G57300.3由于只编码N 端的918个氨基酸，只有前两个结构域（图1（c））.其中DBINO 结构域是INO80亚家族特有的结构域，含有精氨酸和赖氨酸能够结合DNA［28－29］；HELICASE＿ATP＿BIND＿1结构域和HELICASE＿CTER 结构域都含有α－β 结构，并通过这一结构可以结合ATP［30－33］.从结构域上我们推测At3G57300.3产生的截短蛋白能够结合DNA，但是并不具备ATPase活性.

图1 新发现的AtINO80剪切模式示意图Fig.1 Schematic diagram of a novel AtINO80alternative splicing

2.2 At3G57300.3在拟南芥各个器官中的表达量

许多转录本的可变剪切模式会随着发育阶段发生改变，可变剪切也同样受到细胞和组织类型的调控［1，34］.为了解At3G57300.3这一转录本是否具有器官特异性，我们采用RT－PCR 的方法对不同器官AtINO80的表达量进行了检测.由于At3G57300.2和At3G57300.3在5’端的CDS序列是一样的，因此我们在5’端第二个外显子和第三个外显子的位置分别设计了cont－LP和cont－RP这对引物，用于检测总的INO80的表达量（图1（b））；而第15个内含子只有At3G57300.3有表达，我们在第15个内含子和第16个外显子的位置分别设计了splicing－LP和splicing－RP这对引物，用于特异性检测At3G57300.3的表达量.对野生型背景下拟南芥花、花序、茎生叶、茎、莲座叶、幼苗、根以及果荚中AtINO80 总表达量和At3G57300.3表达量的检测结果显示，AtINO80总转录本的相对表达量（以幼苗中为1）花序中最高，果荚中基本检测不到（图2（a）），At3G57300.3占总转录本的比例（图2（b））同样也为花序中最高，可达14.53%，然后依次为花、茎生叶、茎、幼苗、莲座叶和根，在果荚中没有检测到At3G57300.3.因此At3G57300.3的转录具有一定的器官特异性.

为了研究At3G57300.3转录本能否在体内翻译形成稳定的蛋白，我们构建了AtINO80 自身启动子，连接5’－端融合YFP 的AtINO80全长基因组序列的克隆（图2（c）），将其转化到野生型背景下.利用Western blot和YFP抗体，检测了YFP－INO80在花序、莲座叶和幼苗中的含量（图2（d））.在3个组织中都检测到了180kDa的全长蛋白的条带.在花序样品中检测到少量的截短蛋白，大小与预测的At3G57300.3蛋白吻合，而在莲座叶和幼苗的材料中没能够检测到明显的截短蛋白条带.这一结果与花序中At3G57300.3占总转录本的比例较高，而在莲座叶和幼苗的材料中含量较低的观察是一致的.

图2 At3G57300.3的转录具有器官特异性Fig.2 Transcription of At3G57300.3has organ specificity

2.3 不同环境条件下At3G57300.3的表达量

在不同环境条件胁迫下，植物的可变剪切模式会发生改变［1］.酵母中的研究表明INO80在基因毒试剂引发的DNA 损伤修复过程以及细胞周期检测点通路中发挥了重要的功能［20－22］，为了解At3G57300.3是否随外界环境的变化而发生改变，选取HU，MMS，BLM 以及UV－C对野生型进行了处理.其中HU 能够抑制DNA 的合成，从而导致复制叉停滞；MMS 能够引发DNA 的单链和双链断裂；BLM 可以引发DNA 双链断裂.酵母的研究发现缺失IN80的突变体对HU 和MMS以及紫外辐射敏感，并且INO80对于维持HU 胁迫下的复制叉的稳定是必须的［22，35－36］.实验结果显示在HU 和UV－C处理下，AtINO80总转录本的相对表达量（取未处理材料为1）（图3（a））和At3G57300.3转录本占总转录本的比例（图3（b））都下调；在MMS，BLM 处理下AtINO80总转录本的相对表达量（图3（a））基本保持不变，而At3G57300.3转录本占总转录本的比例都有一定程度的下调（图3（b））.

高温和高盐是植物生长过程中常见的环境胁迫.因此我们用37℃和150mmol／L NaCl对野生型进行了处理，结果显示，37℃处理下AtINO80总转录本的相对表达量基本维持不变，At3G57300.3转录本占总转录本的比例有明显的下调；而NaCl处理后AtINO80总转录本的相对表达量和At3G57300.3转录本占总转录本的比例都有所上升（图3）.化学试剂通过激活内源性的应激反应也能引起耐逆性，ABA在盐和干旱引发的胁迫信号转导和积累中起着重要的作用，从而诱导适应胁迫所需要的基因［37－39］.因此我们检测了ABA 处理后At3G57300.3的转录情况，发现ABA 处理后AtINO80总转录本的相对表达量基本不变，At3G57300.3转录本占总转录本的比例有一定程度的下调（图3）.我们推测At3G57300.3可能在高盐胁迫下发挥着与在其他条件下不同的生理功能.

图3 不同环境条件下AtINO80可变剪切的转录发生改变Fig.3 Transcription of AtINO80changes response to different conditions

2.4 AtINO80－Z结构域与H2A.Z－H2B的相互作用

SWR1和INO80同属于INO80 家族染色质重塑因子.详实的证据表明，SWR1 结合组蛋白变体H2A.Z，并负责掺入H2A.Z至核小体中.H2A.Z变体在序列上有别于普通的H2A 蛋白，掺入H2A.Z的核小体被赋予不同的生理与生化特性.在拟南芥中，H2A.Z被证实参与基因转录调控、基因组稳定性、DNA 修复以及异染色质分布等过程，是重要的一类表观遗传学因子［11，40－41］.近期的结构分析表明，SWR1位于ATPase结构域N 端的（599～627aa）区域，含有若干ΦxxΦΦ 基序（Φ 为除glycine以外的疏水残基）.ΦxxΦΦ 基序介导SWR1与H2A.Z－H2B二聚体的特异性结合，因而SWR1N 端（599～627aa）区域被命名为SWR1－Z结构域［42］.

作为同一家族的蛋白，INO80 有着与SWR1 类似的蛋白结构.使用DNAStar MegAlign 软件对INO80和Swr1－Z结构域进行了蛋白序列比对，发现INO80 中也存在某一区段（301～584aa）含有与Swr1－Z结构域类似的基序.将这一区段命名为INO80－Z结构域（图4（a））.

图4 INO80－Z结构域能够在体外结合H2A.Z－H2BFig.4 INO80－Z domain can combind with H2A.Z－H2Bin vitro

然后我们构建了N 端融合GST 的INO80－Z结构域的克隆，使用原核表达系统表达并纯化了GSTINO80－Z结构域融合蛋白.H2A.Z在体内与H2B形成H2A.Z－H2B复合体.利用H2A.Z－H2B嵌合蛋白进行了体外pull－down实验探究INO80－Z结构域与H2A.Z－H2B的结合，实验引入GST 作为负对照，结果显示，我们截取的INO80－Z 结构域能够在体外结合H2A.Z－H2B（图4（b））.At3G57300.3蛋白包含INO80－Z结构域，但缺少完整的ATPase结构域.推测该截短蛋白在体内可能结合H2A.Z，但不发挥相应的染色质重塑活性.在植物发育的不同阶段，AtINO80可能通过不同的剪切方式，调整对H2A.Z变体的染色质重塑的功能.

3 讨论

植物是固着生长的，这一点使得它们不得不通过相关的分子机制来适应外界的不良环境.适应的结果是大量基因的表达发生了改变，植物获得了耐受性.Pre－mRNA 的剪切是基因转录后调控的重要步骤，它影响了基因的表达，产生了丰富多样的mRNA.目前，全基因组研究表明可变剪切在植物中大量存在，并且在植物不同发育阶段以及应对不同环境时基因的可变剪切模式会发生改变.对于可变剪切的研究将有利于我们筛选有利于植物抗逆的转录本，用于相应的遗传工程［1，10，43］.染色质重塑因子在表观调控中起着重要的作用，酵母和人类的研究表明INO80在基因的转录调控、DNA 损伤修复、细胞周期检测点通路以及DNA 复制等方面起着重要的作用，然而在模式植物拟南芥中，人们对它的功能研究较少.我们在对其展开进一步的功能分析时，意外发现了它的一种新的剪切模式.

At3G57300.3编码了一个只含有918个氨基酸残基的截短蛋白，只保留了全长INO80蛋白N 端的DBINO 结构域和HELICASE＿ATP＿BIND＿1结构域，因而我们推测截短蛋白只保留了结合DNA 的功能和部分结合ATP的功能.对At3G57300.3表达谱的定量PCR 分析显示，除了果荚之外，At3G57300.3在植物各个器官都有一定程度的表达，在花序和花中所占INO80总转录本的比例最高，可达14.53%，而在根中的表达量最低，果荚中基本检测不到.我们将Promoter（INO80）∶∶YFP∶∶INO80这一克隆转化到野生型背景下，利用商品化的YFP抗体，通过Western blot我们在花序材料中检测到了编码产生的截短蛋白，暗示截短蛋白在花序发育中可能具有一定的生理功能.

考虑到外界环境的变化会影响可变剪切的模式，酵母INO80具有DNA 损伤修复的功能，我们用各种诱发DNA 损伤的基因毒试剂以及UV－C 对野生型进行了处理，发现At3G57300.3转录本下调，暗示着At3G57300.3可能不参与DNA 的损伤修复.并且在高温和ABA 胁迫下At3G57300.3的转录也发生了下调，而在盐胁迫条件下，At3G57300.3的转录反而有所上升.以上这些结果也同样说明了不同环境会导致可变剪切模式发生改变，截短蛋白在特定的环境胁迫下可能具有不同的生物学功能.

我们通过蛋白序列比对找到了含有与Swr1－Z 结构域类似基序的INO80－Z 结构域，通过体外pulldown实验验证了INO80－Z结构域能够结合H2A.Z－H2B.At3G57300.3产生的截短蛋白包含有INO80－Z结构域.我们猜想截短蛋白同样能够依靠INO80－Z结构域结合H2A.Z，由于缺乏完整的ATPase结构域，我们目前还不清楚截短蛋白在体内是否发挥拮抗或者其它的功能.H2A.Z被证实调控很多应答基因（responsive genes）的转录调控.At3G57300.3转录本在不同外界环境下发生改变，这其中是否存在着功能上的联系，目前还不清楚，有待于未来更深入的研究去揭示.此外，At3G57300.3转录本在花和花序中的表达量相对较高，也暗示着截短蛋白可能在植物生殖发育过程中发挥着功能.

综上所述，我们发现了拟南芥染色质重塑因子INO80的一个新的剪切模式，命名为At3G57300.3，该可变剪切编码了含有918个氨基酸的截短蛋白，其转录具有器官特异性并且在不同基因毒试剂以及其他条件处理下其转录也有一定程度的变化.该截短蛋白包含有INO80－Z 结构域，在体外能够结合H2A.Z－H2B，但是对于这种结合相应的体内的生理功能以及如何特异性的发挥作用还是未知的.同时INO80是一个重要的表观遗传因子，在酵母以及人类中的研究表明INO80具有重要的功能，目前我们对于拟南芥中INO80的功能还知之甚少，对拟南芥INO80的功能展开深入研究将有助于我们了解在植物生长和发育过程中染色质重塑因子的表观调控机理和受其调控的相关生命活动.

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