淞江鲈肝脏组织cDNA文库的构建与部分EST测序

许 耀，刘庆全，罗武松，秦志浩，王金秋

（1.复旦大学 遗传工程国家重点实验室，上海 200438；2.上海四鳃鲈水产科技发展有限公司，上海 200438）

淞江鲈（Trachidermus fasciatus Heckel），隶属鮋形目（Scorpaeniformes），杜父鱼科（Cottidae），淞江鲈属（Trachidermus）［1］.历史上，该物种曾广泛分布于中国的东南沿海及朝鲜半岛、日本一带；近年来，随着人类工业活动的破坏，其野生种群数量骤减.据王金秋等所作调查，现今中国境内仅有辽宁鸭绿江流域、山东青龙河流域和长江口－杭州湾一带尚有三个相互独立的野生种群存在［2］，为加强保护，我国政府已将其列为国家二级保护动物［3］.为从本质上把握淞江鲈生命现象的内在规律，更科学地对其加以保护和利用，近年来，对该物种遗传背景的研究日益增多，陆续有一些功能基因被克隆出来，并进行了表达情况分析或功能研究［4－10］，其线粒体全基因组也已经测序完成［11］.然而，由于相关研究起步较晚，基础还很薄弱，迄今为止在NCBI的Genbank中只收录了13个淞江鲈基因，不到270条该物种核苷酸序列.相关资料的严重匮乏，制约了相关研究的深入.

以组织细胞中的mRNA 为模板，逆转录合成双链cDNA，将各cDNA 分别插入载体形成重组子，再将重组子导入宿主细胞进行克隆扩增，这些重组子内所含cDNA 片段的集合，即为cDNA 文库.利用文库载体上克隆位点两侧的序列作为通用引物，对从cDNA 文库中随机选出的克隆进行5’端或3’端的一次性单向测序，获得一段约长300～500bp的序列，即为表达序列标签（Expressed Sequence Tag，EST）.当下，构建cDNA 文库并进行大规模EST 测序已成为发现新基因和研究基因表达的重要方法，多种重要经济鱼类如鲤鱼（Cyprinus carpio）［12］、草鱼（Ctenopharyngodn idellus）［13］、石斑鱼（Epinephelus coioides）［14］、文昌鱼（Branchiostoma belcheri）［15］等的多种不同组织均已建立起cDNA 文库，并通过EST测序获得了大量有研究和开发价值的新基因，而淞江鲈的相关研究还未见报道.

本文用人工养殖条件下的成鱼构建淞江鲈肝脏组织cDNA 文库，通过测序首次获得了该物种的批量EST 序列并提交dbEST 数据库，且从中筛选出了一批淞江鲈基因，为进一步的研究奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源

人工养殖雌性淞江鲈（Trachidermus fasciatus Heckel）成鱼一条，采自复旦大学淞江鲈项目组松江养殖示范基地.

1.1.2 主要试剂及仪器

TRIzol试剂购自Invitrogen公司；构建cDNA 文库所用SMART cDNA Library Construction Kit和Advantage 2Polymerase Mix购自Clontech公司；纯化PCR 产物所用QIAquick PCR Purification Kit购自Qiagen公司；SfiⅠ酶为NEB 公司出品；分子量标记DL2000 Marker为TaKaRa公司出品；Sanprep柱式质粒DNA 小量抽提试剂盒为生工生物工程（上海）公司产品；测序用BigDye Terminator V3.1Cycle Sequencing Kit为ABI公司产品.PCR 仪为Bio－rad MyCycler；电泳仪和凝胶成像仪为Tanon HE－120和2500；紫外分光光度计为Thermo Nanodrop2000；DNA 测序仪为ABI 3730xl DNA Analyzer.

1.2 方法

1.2.1 总RNA 的提取及cDNA 文库的构建

活体解剖淞江鲈，取出其肝脏，切取约0.2g组织，置于液氮中充分研磨.按照TRIzol试剂使用说明书提取总RNA.取2μL 总RNA，用紫外分光光度计测定OD260／OD280和OD260／OD230值；另取5μL 总RNA 上样于1%琼脂糖凝胶，120V 电泳15min，用凝胶成像仪检测，剩余总RNA 样品置于－80℃冰箱保存备用.取2μL总RNA为模板，按照SMART cDNA Library Construction Kit说明书进行操作，先在逆转录酶作用下合成cDNA第一链，再用LD－PCR合成cDNA 第二链并扩增cDNA.取5μL双链DNA 进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余双链DNA 先后经蛋白酶K 消化、SfiⅠ酶切及SPIN－400柱纯化滤去较小cDNA片段后，用T4DNA连接酶连接到同样经SfiⅠ酶切处理的pUC19改良载体上，获得重组质粒.将重组质粒与大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞混合，42℃热激90s完成转化，即得质粒cDNA文库.

1.2.2 cDNA 文库的鉴定

（1）库容的测定 导入重组质粒的大肠杆菌在不含抗生素的LB液体培养基中复苏培养45min后，取菌液的1／1 000涂布到含氨苄青霉素（Amp）和IPTG／X－gal的LB 固体培养基上，37℃过夜培养，待菌落长出后，数出菌落个数，即可计算出文库的库容.

（2）重组率的测定 在上述平板中，分别数出蓝色和白色菌落的数目，其中白色菌落为重组成功者，可由此计算出文库重组率.

（3）插入片段的长度分析 在上述平板中，用灭菌牙签随机挑取24个菌落，接种到含Amp的LB液体培养基中培养，并用通用引物M13R（5’－CAGGAAACAGCTATGACC－3’）和M13F（5’－TGTAAAAC GACGGCCAGT－3’）进行菌液PCR，1%琼脂糖凝胶电泳检测各组PCR 产物.

1.2.3 EST 测序

取更多的文库菌液液体培养，涂布含Amp的LB固体培养基，37℃过夜培养后，随机挑取2200个克隆，按照BigDye Terminator V3.1Cycle Sequencing Kit的说明书，对文库插入片段进行5’端单向测序，所得序列用NCBI的VecScreen软件剔除载体序列、接头序列后，提交NCBI的dbEST数据库，获取序列号.

1.2.4 对EST 序列的初步分析

用CAP3软件对原始EST 序列进行拼接，拼接所得结果与公共数据库KOG、KEGG 和GO 等进行BLAST 比对，取相似度＞30%且e＜1×10－5的注释，进行基因功能分类.

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取及检测

抽提共获得200μL淞江鲈肝脏组织总RNA，经紫外分光光度计测定，其浓度为0.46μg／μL，因而可以计算出所得总RNA 为91μg，而其OD260／OD280和OD260／OD230均为2.10.

琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1（a）所示，在加样孔位于图片上方的看图模式下，上面一条带为28S RNA，下面一条带为18SRNA，其中28SRNA 条带的亮度约为18SRNA 条带亮度的2倍，2条带均清晰可辨，说明无降解，而5SRNA 条带不明显.综上所述，所得总RNA 质量合格，可以用于后续实验.

2.2 双链DNA的合成

将LD－PCR 所得的双链DNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测（图1（b）），可见合成的cDNA最短的在250bp左右，最长的则超过2 000bp.值得一提的是，由于淞江鲈肝脏组织这一样品自身的原因，双链DNA 在1 000bp附近有一条极亮的条带，说明在该位置可能有些基因丰度极高，可能导致测序时产生冗余.

2.3 文库的鉴定

图1 淞江鲈肝脏组织总RNA 和cDNA 的电泳检测Fig.1 Analysis of roughskin sculpin hepatic total RNA and cDNA by agarose gel－electrophresis

2.3.1 库容和重组率的测定

经37℃过夜培养，在含Amp和IPTG／Xgal的LB固体培养基上共长出1 498个菌落，据此计算出文库的库容约为1.5×106个独立克隆.在这1 498 个菌落中，有1 416 个为白色，剩下82个为蓝色.根据蓝白斑筛选的α－互补原理，白色菌落为重组成功者，故重组率为1 416／1 498＝94.5%.

2.3.2 插入片段的长度分析

从平板上长出的1 416个阳性克隆中，随机挑取24个进行液体培养，菌液PCR 扩增插入片段的电泳图谱如图2所示.由图可知，插入片段长度在500～2 000bp之间，平均插入片段长度约为1 100bp.

图2 24个阳性克隆的菌液PCR 产物电泳检测Fig.2 Analysis of bacteria liquid PCR of 24positive clones by agarose gel－electrophresis

2.4 EST测序

随机挑取2 200个阳性克隆进行5’端单向测序后，剔除载体序列、接头序列和短于100bp的序列后，共得到2 002 条高质量EST 序列，提交NCBI的dbEST 数据库，获得登录号JZ774993～JZ775545、JZ820916～JZ822364.

2.5 对EST序列的初步分析

从2002条EST 序列中共筛选出471个基因，对其进行了KOG 功能分类预测、KEGG 注释和GO 功能分类注释.

2.5.1 KOG 功能分类预测

对各基因所编码的蛋白序列进行KOG 功能分类预测，共有216个蛋白被注释上21种KOG 分类.注释上样本基因最多的3个KOG 分别为“总体功能仅为预测（General function prediction only）”（29个蛋白），“翻译后修饰，蛋白折叠，分子伴侣（Posttranslational modification，protein turnover，chaperones）”（24个蛋白）和“翻译，核糖体结构与生物合成（Translation，ribosomal structure and biogenesis）”（22个蛋白）.

2.5.2 KEGG 注释

共有186个基因注释上175个KO，139个基因注释上195个代谢通路（pathway）.注释上蛋白最多的3个通路分别是KO04610“补体和凝结级联反应（Complement and coagulation cascades）”（20个基因），KO03010“核糖体（Ribosome）”（18 个基因）和KO05010“阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease）”（9 个基因）.

2.5.3 GO 功能分类注释

有312个蛋白被注释上GO 分类.如图3所示，样本基因的功能在“生物过程（Biological process）”功能分类中主要集中于“细胞过程（Cellular process）”和“代谢过程（Metabolic process）”；在“细胞成分（Cellular component）”主要集中于“细胞（Cell）”和“细胞成分（Cell part）”；在“分子功能（Molecular function）”分类中主要聚集于“结合（binding）”和“催化功能（catalytic function）”.

图3 Level 2水平GO 注释上的基因分布Fig.3 GO classification under Level 2

3 讨论

3.1 cDNA文库的质量

cDNA 文库的质量直接影响着文库的使用价值，而对文库质量的评价，一般从文库的代表性和插入片段序列完整性两个方面着手［16］.

文库的代表性，是指文库中所包含的重组cDNA 分子反映来源细胞中mRNA 种类的完整性.库容是衡量文库代表性的重要指标，其定义为构建的原始cDNA 文库中所包含的独立重组子克隆数，一般认为，原始文库的库容量大于106数量级即可说明其代表性较好［16－18］.本文所建的cDNA 文库经测定，库容达到1.5×106，且重组率达到94.5%，说明代表性较好，可以用于后续的研究工作.

插入片段序列完整性，则是指插入片段能否尽可能多地反映所代表基因的信息，为此，应尽可能提高插入片段的全长比例.目前，已经建立起Oligo－capping 法［19］、CAPture 法［20］、SMART 法［21］、CAPtrapper法［22］等多种构建全长cDNA 文库的方法，本文所用的SMART 法即为其中一种广泛采用的经典方法，由Clontech公司创建［23－24］.一般认为，插入片段序列较为完整的cDNA 文库，其平均插入片段长度应在1 000bp以上，而实际测定表明，本文所建文库的平均插入片段长度达到1 100bp左右，再次证明文库质量较高，可以用于后续研究.

3.2 EST测序及对未来工作的展望

EST 测序既可以从5’端进行，也可以从3’端进行，但一般情况下，由于mRNA 的3’端有一个poly（A）结构，在该结构附近又有特异性的非编码区，因此如果从这一端开始测序，所能获得的编码区序列信息将较少；相对而言，5’端附近所含的非编码区较少，包含的有效信息量更大，适合于寻找新基因或研究基因的差异表达［25－26］.

尽管EST 测序用以寻找新基因已经成为一种成熟且常用的研究手段，但在淞江鲈的遗传研究中，相关工作还是一片空白.在本文之前，NCBI的dbEST 数据库中尚无1条淞江鲈EST 序列被收录，因而本文的研究填补了相关领域的一个重要空白.

肝脏的主要功能是蛋白质合成与机体防御.本文通过对淞江鲈肝脏组织cDNA 文库中的部分基因进行功能分类，发现在注释上蛋白最多的3个KOG 分类中有2个是关于蛋白质合成的，KO03010“核糖体（Ribosome）”通路在KEGG 注释中高居第二，这些均与肝脏的蛋白质合成功能相一致；此外，在KEGG 注释中还发现，肝脏中与KO04610“补体和凝结级联反应（Complement and coagulation cascades）”和KO05010“阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease）”通路相关的基因数量较多，这也印证了肝脏在机体防御中的重要作用.

在今后，可以利用本文所构建的文库，测定出更多的EST 序列，并通过生物信息学手段，筛选出更多具有研究和利用价值的新基因，所以本文的研究工作也为今后的相关工作奠定了基础.

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