线粒体DNA拷贝数的研究新进展

张素素(综述)，孙 嘉(审校)

(1.南方医科大学第二临床医学院临床医学系，广州 510282； 2.南方医科大学珠江医院内分泌科，广州 510282)

线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是唯一存在于细胞器中且相对独立的基因组，可控制和编码部分蛋白质，其在基因组中的个数称为mtDNA拷贝数。近年来，mtDNA拷贝数是肿瘤领域的研究热点之一。mtDNA拷贝数的变化可能在肿瘤及多种疾病的发生、发展过程中发挥至关重要的作用。与核基因组相比,mtDNA缺乏有效的损伤修复系统，更易受环境、遗传等因素影响，造成复制、转录水平及拷贝数发生变化，但其变化的具体机制尚不明确，对mtDNA拷贝数进行研究是不断深入了解线粒体的重要途径之一。

1 mtDNA拷贝数的定义

mtDNA拷贝数是mtDNA在线粒体基因组中的个数，每个线粒体含有2～10个mtDNA拷贝数。正常人每个体细胞mtDNA拷贝数为103～104，在不同类型的组织中具有一定特异性，每个外周血单个核细胞、肌细胞、神经元中分别为223～854、1075～2794、1200～10 800[1]。

2 mtDNA拷贝数的调控

有学者认为，可能存在一个较低的mtDNA拷贝数阈值，mtDNA拷贝数低于该值会触发激活mtDNA复制，以提高mtDNA拷贝数；而当mtDNA拷贝数升高超过另一阈值时，会激活mtDNA的降解机制，降低mtDNA拷贝数[2]。目前存在几种mtDNA拷贝数调控模式假说：ATP的需要量决定mtDNA的含量，但目前并无证据支持这一说法；核苷酸的利用率决定mtDNA的复制；mtDNA拷贝数受到多个复制起源的调控；线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)通过影响mtDNA复制改变其拷贝数[2]。

2.1TFAM与mtDNA拷贝数 TFAM是第一个被确定的mtDNA转录因子，由核染色体10q21编码,含2个高迁移率蛋白结构域。人类细胞中约10 bp的mtDNA对应1分子TFAM蛋白，每个mtDNA约结合1000个TFAM分子[3]。根据链置换模型，哺乳动物mtDNA复制与转录偶联在一起，TFAM介导mtDNA含量增加的可能机制有两种：TFAM较高频率地结合于轻链启动子，提升转录介导的复制启始；TFAM结合全基因组，可能通过降低DNA的更新速率以稳定mtDNA的稳态水平[4]。亦有学者认为，上述两种机制并非相互排斥，主张一种通过调节TFAM活动的多元模式控制mtDNA拷贝数的变化；除了调节转录起始，TFAM大量且非特异地结合线粒体基因组，形成DNA环，引起超螺旋化，散在分布的点状蛋白-DNA结构形成类核[4]。类核是线粒体基因组的功能单位，保证mtDNA免受多种损害。研究发现，TFAM结合mtDNA，可对抗人β淀粉样蛋白1-42对人神经母细胞瘤细胞氧化呼吸链的损伤，其机制可能是TFAM过表达可维护线粒体类核结构及调节mtDNA拷贝数，从而改变细胞生存能力，降低细胞凋亡率[5]，可见TFAM可能与通过类核结构保护mtDNA免受氧化损伤有关，从而调控mtDNA拷贝数。

2.2同源重组修复蛋白Rad51与mtDNA拷贝数 同源重组修复蛋白Rad51是真核细胞染色体同源重组的重要催化剂，主要存在于线粒体内膜基质，参与mtDNA水平的维护。Sage等[6]发现，Rad51重组酶以及Rad51c和Xrcc3旁系同源蛋白的协同作用可调节脊椎动物受损染色体DNA的复制叉进程，三者减少会导致mtDNA拷贝数减少。无复制抑制因素存在时，Rad51缺乏可导致mtDNA拷贝数整体下降45%～50%，提示mtDNA的成功复制需要Rad51[7]。可见，Rad51对mtDNA拷贝数的调控作用可能是当复制叉遭遇损伤停滞时，参与完成mtDNA的准确复制。

2.3DNA聚合酶γ与mtDNA拷贝数 DNA聚合酶γ(polymerase γ，polγ)是目前已知唯一存在于线粒体内的线粒体特异性DNA聚合酶，由一个polγ催化亚基(polγA)和两个附属亚基(polγB)组成，分别由不同的核基因编码。polγ在mtDNA的复制和维护中必不可少，polγA的病理突变以mtDNA的缺失或消耗为特征。polγA对mtDNA的调控在一定程度上受核DNA甲基化的影响。老鼠出生后的干细胞中，核DNA甲基化与polγA的表达呈一定负相关性。编码polγA的核基因CpG岛上外显子2高度甲基化，影响该CpG岛下游的延伸及polγA的前体mRNA选择性剪切和激活，抑制mRNA表达水平，从而影响mtDNA复制[8]。此外，基因启动子区域的CpG岛处于非甲基化状态，发生甲基化时可导致基因沉默。这在一定程度上可以解释DNA甲基化水平高，polγ表达水平和mtDNA拷贝数低的现象。

3 氧化应激对mtDNA拷贝数的影响

mtDNA没有组蛋白保护，缺乏抗氧化机制和有效修复系统，且接近线粒体内膜电子传递链，极易受周围活性氧类(reactive oxygen species,ROS)的损伤。当ROS超过内源性抗氧化防御系统的消除能力时，氧化/抗氧化失衡，会导致氧化应激的出现。在氧化应激作用下，mtDNA拷贝数可能升高或降低。妊娠糖尿病患者胎盘mtDNA拷贝数与氧化应激水平呈正相关，而在心力衰竭患者心肌组织中则呈负相关[9-10]。氧化应激在受影响的细胞中可能扮演两种角色：一方面，轻度氧化应激损伤线粒体氧化呼吸链，可刺激线粒体及mtDNA分子的增加以代偿减弱的线粒体呼吸功能，保证细胞的存活、损伤修复及所需蛋白质的合成；另一方面，氧化应激导致ROS的增加和氧化损伤的进一步加剧，超过某一阈值时，导致线粒体功能障碍甚至细胞死亡[11]。mtDNA的D-环区是mtDNA中两段主要非编码区之一，调控mtDNA的复制和转录，其对氧化应激敏感，易引起基因突变，影响mtDNA的复制和转录而导致mtDNA拷贝数下降[12]。氧化应激还可通过TFAM影响mtDNA拷贝数的变化，肝外胆汁淤积患者体内肝脏氧化/抗氧化失衡，随氧化应激水平升高，TFAM及mtDNA拷贝数均呈下降趋势[13]。Sage等[6]发现，氧化应激条件下TFAM优先结合氧化损伤的mtDNA，且结合率上升。可见，氧化应激条件下TFAM有保护mtDNA的作用[13]。

4 机体不同疾病状态下mtDNA拷贝数的变化

4.1mtDNA拷贝数与骨质疏松 Kim等[14]发现，绝经后妇女外周血mtDNA拷贝数减少与股骨颈骨密度降低有统计学意义，但与椎体骨密度无关联性，其原因可能是基因在椎体受影响较小或生物力学对椎体与股骨颈骨密度变化影响不一致。绝经后妇女雌激素水平显著下降，抗氧化能力减弱，补充雌激素可降低氧化应激水平并增强抗氧化作用[15]。但Kim等[14]的研究未检查受试者外周血氧化应激水平，故对于氧化应激是否是连接mtDNA拷贝数与BMD变化的中间纽带有待进一步研究。

4.2mtDNA拷贝数与糖尿病及其并发症 mtDNA拷贝数与糖尿病患者体内的脂肪氧化速率、胰岛素敏感性及胰岛素分泌呈正相关[16]。糖尿病视网膜病变大鼠病程初期，线粒体损伤防御机制活跃，TFAM、D-环区mtDNA-TFAM复合物、polγ及mtDNA拷贝数升高；随着病程进展，mtDNA修复和复制机制不堪重负开始崩解；病程6个月时线粒体DNA功能受损，TFAM、mtDNA-TFAM复合物减少，mtDNA拷贝数下降。且糖尿病高糖血症容易引起氧化应激，早期通过刺激polγ、TFAM等促进mtDNA拷贝数增加，以代偿线粒体功能障碍。随着氧化应激加剧，代偿机制崩溃，polγ、TFAM减少，mtDNA拷贝数随之下降[17]。

4.3mtDNA拷贝数与心血管疾病 心脏在体内具有最高的摄氧率，心力衰竭患者心肌组织氧化应激水平升高，过氧化物还原酶3过表达，使用线粒体抗氧化剂或TFAM增加可以改善mtDNA拷贝数减少的现象，从而改善心力衰竭的病理生理进程[10]。3～4个月龄心脏功能正常的小鼠，随mtDNA拷贝数下降和氧化应激水平增加可发生严重异常情况[18]。可见，mtDNA拷贝数下降可能是预测心肌病的发生、发展的因素之一。提高mtDNA拷贝数能减缓循环压力超负荷小鼠模型左心室心肌纤维化进程，可成为治疗高血压性心脏病的新途径[19]。

4.4mtDNA拷贝数与肿瘤 线粒体对许多致癌因素敏感，mtDNA拷贝数的变化与多种肿瘤的发生、发展具有相关性。外周血mtDNA拷贝数减少可导致线粒体氧化磷酸化产生ATP减少的同时伴糖酵解的增强，增加肝细胞癌、进展期胃癌、肾细胞癌等风险，低mtDNA拷贝数者肾细胞癌患病率比对照组高1.56倍[1,20]。在肺癌、胰腺癌等肿瘤中，mtDNA拷贝数增高；而大肠癌与mtDNA拷贝数过低或过高均有关，呈U形曲线关系[21]。mtDNA拷贝数与某些肿瘤分化程度成反比，过去认为乳腺癌患者mtDNA拷贝数减少；Xia等[22]发现Ⅰ期乳腺癌患者mtDNA拷贝数呈低水平，而Ⅱ～Ⅳ期患者则增高。这可能与mtDNA受ROS不断攻击，复制增强以及代偿能量需求有关。一项最新研究显示，患者乳腺癌确诊前3年的外周血mtDNA拷贝数下降，提示亚临床乳腺癌也会影响mtDNA拷贝数的变化[23]。故mtDNA拷贝数变化可能是肿瘤发生过程中的一个早期事件。

5 结 语

关于mtDNA拷贝数的研究越来越多，涉及的范围愈加广泛，随着科学研究的不断发展，越来越多疾病被发现与mtDNA拷贝数的变化具有相关性，mtDNA拷贝数变化受环境、遗传等因素影响，其中氧化应激作用是重要因素之一，不同因素对mtDNA拷贝数具体调控机制有待更多的研究去阐明。如何根据mtDNA拷贝数的变化对疾病的发生、发展做出预测及恰当治疗，也将是今后研究的重要方向。

[1] Xing J,Chen M,Wood CG,etal.Mitochondrial DNA content: its genetic heritability and association with renal cell carcinoma[J].J Natl Cancer Inst,2008,100(15):1104-1112.

[2] Clay ML,Deng JJ,Bai Y.Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number[J].J Genet Genomics,2009,36(3):125-131.

[3] Matsuda T,Kanki T,Tanimura T,etal.Effects of overexpression of mitochondrial transcription factor A on lifespan and oxidative stress response in Drosophila melanogaster[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,430(2):717-721.

[4] Campbell CT,Kolesar JE,Kaufman BA.Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number[J].Biochim Biophys Acta,2012,1819(9/10):921-929.

[5] Xu S,Zhong M,Zhang L,etal.Overexpression of Tfam protects mitochondria against beta-amyloid-induced oxidative damage in SH-SY5Y cells[J].FEBS J,2009,276(14):3800-3809.

[6] Sage JM,Gildemeister OS,Knight KL.Discovery of a novel function for human Rad51:maintenance of the mitochondrial genome[J].J Biol Chem,2010,285(25):18984-18990.

[7] Sage JM,Knight KL.Human Rad51 promotes mitochondrial DNA synthesis under conditions of increased replication stress[J].Mitochondrion,2013,13(4):350-356.

[8] Kelly RD,Mahmud A,Mckenzie M,etal.Mitochondrial DNA copy number is regulated in a tissue specific manner by DNA methylation of the nuclear-encoded DNA polymerase gamma A[J].Nucleic Acids Res,2012,40(20):10124-10138.

[9] Qiu C,Hevner K,Abetew D,etal.Mitochondrial DNA copy number and oxidative DNA damage in placental tissues from gestational diabetes and control pregnancies: a pilot study[J].Clin Lab,2013,59(5/6):655-660.

[10] Tsutsui H,Kinugawa S,Matsushima S.Oxidative stress and mitochon-drial DNA damage in heart failure[J].Circ J,2008,72(Suppl A):31-37.

[11] Lee HC,Wei YH.Mitochondrial biogenesis and mitochondrial DNA maintenance of mammalian cells under oxidative stress[J].Int J Biochem Cell Biol,2005,37(4):822-834.

[12] Li H,Liu D,Lu J,etal.Physiology and pathophysiology of mitochondrial DNA[J].Adv Exp Med Biol,2012,942:39-51.

[13] Xu SC,Chen YB,Lin H,etal.Damage to mtDNA in liver injury of patients with extrahepatic cholestasis: the protective effects of mitochondrial transcription factor A[J].Free Radic Biol Med,2012,52(9):1543-1551.

[14] Kim JH,Lee DC.Mitochondrial DNA copy number in peripheral blood is associated with femoral neck bone mineral density in postmenopausal women[J].J Rheumatol,2012,39(7):1465-1472.

[15] Evsen MS,Ozler A,Gocmez C,etal.Effects of estrogen, estrogen/progesteron combination and genistein treatments on oxidant/antioxidant status in the brain of ovariectomized rats[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2013,17(14):1869-1873.

[16] Cho YM,Park KS, Lee HK.Genetic factors related to mitochondrial function and risk of diabetes mellitus[J].Diabetes Res Clin Pract,2007,77(Suppl 1):172-177.

[17] Santos JM,Tewari S,Kowluru RA.A compensatory mechanism protects retinal mitochondria from initial insult in diabetic retinopathy[J].Free Radic Biol Med,2012,53(9):1729-1737.

[18] Chen L,Liu T,Tran A,etal.OPA1 mutation and late-onset cardiomyopathy: mitochondrial dysfunction and mtDNA instability[J].J Am Heart Assoc,2012,1(5):e3012.

[19] Tanaka A,Ide T,Fujino T,etal.The overexpression of twinkle helicase ameliorates the progression of cardiac fibrosis and heart failure in pressure overload model in mice[J].PLoS One,2013,8(6):e67642.

[20] Purdue MP,Hofmann JN,Colt JS,etal.A case-control study of peripheral blood mitochondrial DNA copy number and risk of renal cell carcinoma[J].PLoS One,2012,7(8):e43149.

[21] Thyagarajan B,Wang R,Barcelo H,etal.Mitochondrial copy number is associated with colorectal cancer risk[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2012,21(9):1574-1581.

[22] Xia P,An HX,Dang CX,etal.Decreased mitochondrial DNA content in blood samples of patients with stage Ⅰ breast cancer[J].BMC Cancer,2009,9:454.

[23] Thyagarajan B,Wang R,Nelson H,etal.Mitochondrial DNA copy number is associated with breast cancer risk[J].PLoS One,2013,8(6):e65968.