高效液相色谱法同时测定忍冬藤中7个活性成分的含量

代晶，石明芯，王佳慧，黄丹，黄慧，廖昌军

（成都医学院药学院，四川成都610083）

高效液相色谱法同时测定忍冬藤中7个活性成分的含量

代晶，石明芯，王佳慧，黄丹，黄慧，廖昌军

（成都医学院药学院，四川成都610083）

采用HPLC测定不同市售地、不同直径的忍冬藤药材中各活性成分的质量分数（新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、马钱苷、3，5-二咖啡酰喹尼酸、4，5-二咖啡酰喹尼酸）。色谱柱为Shiseido C18（4.6mm×250mm×5μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸，并进行梯度洗脱，体积流量为1mL/min，柱温为35℃，检测波长为238，326，350 nm。结果显示，上述成分的进样质量与峰面积之间线性关系良好（r＞0.999 5），精密度RSD＜4.3%，重复性RSD＜4.1%，平均加样回收率在96.8%～104.1%。本方法简单、准确，适用于忍冬藤的质量控制。

忍冬藤；高效液相色谱；柱温

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Ultimate3000型高效液相色谱仪（美国Dionex公司）；Discover-SPW/Activent型微波合成仪（美国CEM公司）。绿原酸（批号CAA-111101，购自成都天源天然产物有限公司）；獐牙菜苷和马钱苷（批号分别为M-010-131211、Z-009-131225，购自成都瑞芬思生物科技有限公司）；新绿原酸、咖啡酸、3.5-二咖啡酰奎宁酸和4.5-二咖啡酰奎宁酸（批号分别为14043010、10112201、14022612、14041414，购自成都曼斯特生物科技有限公司）；上述试药纯度均大于98%。乙腈（SWELL公司，色谱纯），其余试剂均为分析纯。忍冬藤购自全国各地。

1.2 色谱条件

Shiseido C18色谱柱（4.6mm×250mm×5μm），流量1.0mL/min，柱温为35℃；流动相为0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～6min，4%→6%B；6～30min，6%→8%B；30～35min，8%～10%B；35～45min，10%→14%B；45～50min，14%B；50～55min，14%→16%B；55～70min，16%→18%B；70～80min，18%→20%B；80～90min，20%→40%B）。新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、3.5-二咖啡酰奎宁酸、4.5-二咖啡酰奎宁酸检测波长是326 nm；獐牙菜苷、马钱苷的检测波长为238nm。

1.3 样品制备

1.3.1 对照品溶液

精密称取各对照品适量，加50%甲醇制得质量浓度为40μg/mL～1mg/mL的贮备液。精密量取上述各贮备液适量，置同一容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，制得混合对照品溶液，其质量浓度分别为：新绿原酸60.0μg/mL、绿原酸150.0μg/mL、咖啡酸12.0μg/mL、獐牙菜苷100.0μg/mL、马钱苷200.0μg/mL、3.5-二咖啡酰奎宁酸50.0μg/mL、4.5-二咖啡酰奎宁酸30.0μg/mL。

1.3.2 供试品溶液

精密称取忍冬藤粉末（过60目筛）0.8 g，加入50%甲醇24mL，精密称定。以微波100W提取5min，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

1.4 方法学验证

本试验对HPLC法进行了线性、精密度、重复性、回收率、稳定性和耐用性试验的验证。

1.5 含量测定与统计分析

将12个市售地的忍冬藤按藤直径分为老藤（＞3mm）、嫩藤（1.5～3mm），按照“1.3.2”和“1.2”的方法制备和测定样品各活性成分的质量分数。应用SPSS17.0软件对不同直径忍冬藤各活性成分的质量分数进行配对T检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

本试验考察了乙腈-甲酸、乙腈-磷酸等流动相。发现在0.2%甲酸溶液中，部分有机酸类成分（如4，5-二咖啡酰奎宁酸）拖尾（见图1）；而乙腈-0.1%磷酸可对各成分较好分离，峰对称性优于甲酸，故作为流动相进行梯度洗脱。由于忍冬藤成分复杂，最大吸收波长差异较大，故试验在一个分析周期内分别在238nm测定獐芽菜苷和马钱苷，在326nm检测绿原酸和二咖啡酰奎宁酸等。按照上述色谱条件进行测定，忍冬藤中各待测物与其他共存峰均得到较好的分离，对照品及样品的色谱图见图2。

图1 不同流动相的4，5-二咖啡酰奎宁酸高效液相色谱图

2.2 样品制备

本试验比较了微波、超声以及加热回流3种提取方法，结果发现微波法提取效率高、用时短。试验又考察了微波功率和提取时间的影响，结果发现当提取功率＞100W、提取时间＞5min时，提取效率无明显增大，因此选择上述参数作为微波提取条件。

图2 对照品、忍冬藤的高效液相色谱图

2.3 线性关系

精密吸取混合对照品溶液1，2，5，10，20，30，40μL进样测定，记录色谱图。以对照品的进样质量为横坐标（X），对照品的峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程，结果显示（见表1）在线性范围内，各成分线性关系良好（r＞0.9995）。

表1 线性范围、回归方程和相关系数

2.4 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10μL，连续进样6次，测得新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、马钱苷、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸峰面积的RSD分别为0.5%、0.3%、1.0%、4.3%、1.0%、1.1%、0.5%，表明仪器的精密度良好。

2.5 重复性试验

取同一批供试品6份，按“1.3.2”的方法制备样品，取10μL进样分析。结果样品中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、马钱苷、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸峰面积的RSD分别为1.8%、0.9%、1.4%、2.9%、2.0%、4.1%、1.4%，表明方法的重复性良好。

2.6 加样回收率试验

取已知含量的样品6份，每份0.4 g，精密称定，再分别精密加入各对照品储备液适量，按“1.3.2”的方法制得样品溶液，取10μL进样分析，计算回收率（见表2），结果显示上述7种成分的回收率为96.8%～103.9%，表明方法准确性良好。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0，12，24，48h进样测定，结果新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、马钱苷、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸峰面积的RSD为1.3%、1.2%、0.7%、1.1%、1.2%、2.9%、0.9%。表明上述7个成分在48h内稳定性良好。

2.8 耐用性试验

取同一供试品溶液，在不同色谱柱以及不同柱温条件下进样测定。结果显示（见表3和表4），虽然色谱柱对样品的保留时间影响大，RSD＞5.1%，但分离效果未受影响，定量结果RSD＜1.9%。而柱温对样品测定影响较小，其中保留时间RSD＜2.7%，含量测定结果RSD＜1.7%。

2.9 含量测定与统计分析

表3 色谱柱对7种成分的保留时间和质量分数的影响

表4 柱温对7种成分的保留时间和质量分数的影响

表5 忍冬藤中7种成分的质量分数1） %

取12个市售地、不同藤径的忍冬藤粉末，按上述方法测定有效成分含量。其中藤茎＜3mm为嫩藤，其表面棕红色至暗棕色，密被短柔毛；而藤茎＞3mm为老藤，其表面棕红色至暗棕色，被茸毛，有的表皮光滑呈灰绿色或表皮脱落。试验结果显示，不同市售地忍冬藤药材质量差异较大，其各成分的质量分数有几倍甚至几十倍的差别，如表5所示。这种差异可能是由忍冬藤的种植地、炮制加工、贮存运输等环节造成的。此外，同一批忍冬藤，不同藤茎的有效成分也有差异，经配对T检验发现，除了3，5-二咖啡酰奎宁酸外，其余各有效成分在老藤和嫩藤中分布显著不同（P＜0.05），其中咖啡酸嫩藤＞老藤，而新绿原酸、马钱苷等老藤＞嫩藤。这可能是不同藤组织结构中有效成分分布不同引起的，也可能是忍冬藤的不同生长期内各成分的生物合成途径或阶段不同导致的，其相关原因与机制有待于深入研究探讨。

3 结束语

本试验建立了同时测定忍冬藤中7个化合物的HPLC方法，并考察了不同市售地和不同藤茎中上述成分的质量分数。结果显示，本试验方法简单、灵敏、准确，适合于忍冬藤的质量控制。多种因素可能影响忍冬藤的质量，其中种植地的影响较为明显，其有效成分质量分数差别有几倍甚至几十倍。而生长期也能够影响忍冬藤的质量，其中老藤质量普遍较好，其有效成分含量普遍高于嫩藤。

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Simultaneous determ ination of seven components in lonicerae japonicae caulis by HPLC

DAI Jing，SHIMingxin，WANG Jiahui，HUANG Dan，HUANG Hui，LIAO Changjun
（School of Pharmacy，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China）

An HPLC method was developed to determine simultaneously the neochlorogenic acid，chlorogenic acid，caffeic acid，sweroside，loganin，3，5-O-dicaffeoylquinic acid and 4，5-O-dicaffeoylquinic acid in Lonicerae Japonicae Caulis.The analysis was performed on a Shiseido C18 column（4.6mm×250mm×5μm），alone with acetonitril e-0.1%H3PO4as the mobile phase and a gradient elution at the flow rate of 1mL/min.The column temperature was maintained at 35℃，and the detection wavelength was set at 238，326 nm and 350 nm.The calibration curves were linear in certain ranges for eight compounds（r＞0.9995）.The precision RSD is lower than 4.3%，the repeatability RSD is smaller than 4.1%，and the average recovery ranged from 96.8%to 104.1%.This method is simple，accurate，and suitable for controlling the quality of Lonicerae Japonicae Caulis.

lonicerae japonicae caulis；HPLC；column temperature

A文章编号：1674-5124（2015）08-0044-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.08.010

0 引言

忍冬藤是我国传统中药，金银花是它的干燥花蕾。研究发现，忍冬藤具有疏风通络、清热解毒的功效，主要治疗温病发热，疮痈肿毒，热毒血痢，风湿热痹等症[1-4]；除人使用外，家畜也使用[5-6]；既能内服，也可外用[7]。此外，忍冬藤资源丰富、产量大，四季均可入药，价格便宜，因而具有良好的开发价值。现阶段市售忍冬藤良莠不齐，嫩枝和老枝混合，而中国药典对忍冬藤的质量要求较为简单，规定其直径为1.5～6mm，绿原酸和马钱苷含量不少于0.1%。目前忍冬藤的定量方法主要有HPLC[1，8-10]、毛细管色谱法[11]、UV法[12]、GC/MS法[13]。为此本试验建立了测定7种成分质量分数的HPLC方法，考察不同市售地和不同直径忍冬藤中各成分的含量，探讨影响其质量的因素，本试验可为忍冬藤的品质评价、科学采收以及合理使用提供科学参考。

2015-04-28；

2015-06-23

四川省教育厅理科重点项目（15ZA0263，12ZA026）

代晶（1979-），女，吉林省吉林市人，讲师，博士，主要从事药物分析与药代动力学研究。