一测多评法用于忍冬藤多成分含量测定的适用性研究

田伟 甄亚钦 王鑫国 田宇柔 李军山 牛丽颖

摘要：目的 建立一测多评法同时测定忍冬藤中绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷6种成分含量的方法，并验证该法在忍冬藤质量控制中应用的可行性与适用性。方法 以绿原酸为内参物，采用Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸，梯度洗脱，流速为1 mL/min，绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C检测波长为327 nm，马钱苷检测波长为236 nm，柱温35 ℃。结果 建立了忍冬藤中绿原酸与咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷的相对校正因子；一测多评法的计算值与外标法实测值无明显差异。结论 一测多评的质量控制模式可用于忍冬藤中6种不同成分的多指标同步质量评价。

关键词：一测多评；相对校正因子；绿原酸；忍冬藤；质量评价

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.017

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）11-0077-06

Abstract： Objective To establish a QAMS method for content determination of six compositions （chlorogenic acid， caffeic acid， cryptochlorogenin acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C and loganin） from Lonicerae Japonicae Caulis； To verify the feasibility and applicability of this method in quality control of Lonicerae Japonicae Caulis. Methods Chlorogenic acid was set as internal reference substance. The HPLC analysis was performed on a Waters Symmetry C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） with a mobile phase consisted of acetonitrile and 0.4% phosphoric acid solution in gradient elution manner at a flow rate of 1 mL/min. The column temperature was maintained at 35 ℃， and the detection wavelength was set at 327 nm for chlorogenic acid， caffeic acid， cryptochlorogenin acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C and 236 nm for loganin. Results The relative correction factors of caffeic acid， cryptochlorogenin acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C and loganin were established； there was no obvious difference between calculated value of QAMS and measured value of external standard method. Conclusion The quality control mode of QAMS can be used for multi-index synchronization quality evaluation of the six compositions from Lonicerae Japonicae Caulis.

Keywords： QAMS； relative correction factors； chlorogenic acid； Lonicerae Japonicae Caulis； quality evaluation

忍冬藤為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝，具有清热解毒、疏风通络功效，用于温病发热、热毒血痢、痈肿疮疡、风湿热痹、关节红肿热痛[1]。忍冬是我国传统药用植物，具有抗菌、抗炎、调节免疫、抗氧化等多种药理作用[2]。《本草纲目》云：“忍冬，茎叶同花，功用皆同。”金银花是忍冬的干燥花蕾或带初开的花，在中药制剂、茶饮、保健品等领域应用广泛，因需求量大，出现供不应求的现状。忍冬藤资源丰富、价格便宜，具有良好的开发前景。

忍冬藤含有有机酸、环烯醚萜苷、黄酮等多类成分[3-4]，2015年版《中华人民共和国药典》仅将马钱苷和绿原酸作为忍冬藤的含量测定指标成分，不能完全反映该药材的真实品质。一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）是利用中药中有效成分函数关系和比例关系，通过测定1个有效成分（性质稳定且易得到的对照品）实现多个成分（性质不稳定且难得到的对照品）的同时测定，该方法快速、简便，是一种符合中药多成分特点的多指标质量评价模式，已广泛应用于中药的质量控制中[5]。为了对忍冬藤进行多指标控制，本研究以绿原酸为内参物，对咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷QAMS同步测定的可行性与适用性进行探讨与评价。

1 仪器与试药

岛津高效液相色谱仪，包括LC-15C泵、SPD-15C型紫外检测器、SIL-10AF自动进样器、CTO-15C柱温箱、岛津LC色谱工作站；美国赛默飞公司Ultimate 3000高效液相色谱仪，包括低压三元梯度泵、自动进样器、DAD检测器、变色龙色谱工作站；沃特世e2695高效液相色谱仪，包括低压四元梯度泵、自动进样器、2489紫外检测器、Empower 3色谱工作站；色谱柱为Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Wondasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；电子天平（TB-215D，德国赛多利斯）；KQ-250E超声波清洗器（昆山市超声仪有限公司）。

绿原酸对照品（批号PY20170216，纯度99.96%）、隐绿原酸对照品（批号PY20170224，纯度99.79%）、异绿原酸C对照品（批号PY20170303，纯度91.88%）、马钱苷对照品（批号PY20170108，纯度99.31%），南京普怡生物科技有限公司；咖啡酸对照品（批号110885-200102，纯度100.00%）、异绿原酸A对照品（批号111782-201405，纯度92.00%），中国食品药品检定研究院，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

20批忍冬藤样品中15批由神威药业集团有限公司提供，另5批分别购自石家庄乐仁堂、新兴药房、德济堂、栀子药房、百医堂，经河北省药品检验研究院孙宝惠主任中药师鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝，编号为1～20。

2 方法与结果

2.1 分析方法的建立和验证

2.1.1 色谱条件

色谱柱为Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相为乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脱（0～30 min，7%A；30～32 min，7%～10%A；32～44 min，10%A；44～50 min，10%～21%A；50～60 min，21%～34%A；60～65 min，34%A）；流速1 mL/min；柱温35 ℃；检测波长：绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C为327 nm，马钱苷为236 nm；进样量10 ?L。色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备

分别精密称取绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷对照品适量，加50%甲醇制成浓度分别为0.097 9、0.020 6、0.007 5、0.054 4、0.021 3、0.169 8 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

取忍冬藤粉末（过3号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 线性关系考察

分别精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液2、4、6、10、15、20 ?L注入液相色谱仪，测定绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1。绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷6种成分在相应范围内呈良好线性关系。

2.1.4.2 精密度试验

精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液10 ?L，连续进样6次，计算绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷的峰面积RSD分别为0.23%、0.28%、0.42%、0.23%、0.10%、0.18%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.3 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于配制后0、2、4、6、10、16 h进样10 ?L，测得绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷的峰面积RSD分别为1.85%、1.68%、1.57%、1.91%、1.66%、1.08%，表明供试品溶液在16 h内稳定。

2.1.4.4 重复性试验

取同一批号忍冬藤样品6份，每份约1 g，精密称定，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别测定绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷的峰面积，计算含量的RSD分别为1.56%、1.08%、1.27%、1.46%、1.17%、0.83%，表明本方法重复性良好。

2.1.4.5 加样回收率试验

取已知含量的样品粉末9份，每份约0.5 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，分别按各成分含量的80%、100%、120%精密加入绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷的对照品贮备液，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率及RSD，结果见表2～表7。表明本方法的准确度良好。

2.2 相对校正因子的确定

2.2.1 相对校正因子的计算

取“2.1.2”项下混合对照品溶液，分别进样2、6、10、16、20 ?L，计算各相对校正因子。fk/m=fk/fm=Wk×Am/（Wm×Ak），式中，Ak为内标物峰面积，Wk为内标物质量，Am为组分m的峰面积，Wm为组分m的质量。以绿原酸为内标物，分别计算咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C和马钱苷的相对校正因子，结果见表8。

2.2.2 相对校正因子重现性考察

按相对校正因子测定条件和方法，分别采用3种不同的色谱仪和3种色谱柱测定，并计算绿原酸对咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C和马钱苷的fk/m，计算平均值，结果见表9。

2.2.3 待测色谱峰定位

采用不同色谱仪及色谱柱，待测组分的保留时间会有所波动，在色谱峰定位中一般采用相对保留时间或保留时间差法[6-8]。取“2.1.2”项下混合对照品溶液，分别采用3种不同色谱仪和3种色谱柱测定，并计算绿原酸对咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C和马钱苷的相对保留时间（rk/m），结果见表10，RSD均小于5%，表明利用相对保留时间进行色谱峰的定位是可行的。

2.2.4 一测多评法与外标法测定结果比较

首先采用外标法（extermal standard method，ESM）对忍冬藤中绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C和马钱苷进行多成分同步定量测定，再用建立的QAMS方法计算咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C和马钱苷的质量。Wm=Wk×Am/（fk/m×Ak），式中，Ak为内标物峰面积，Wk为内标物进样量（质量），Am为组分m峰面积，Wm为组分m的质量。

每批样品分别用2种方法平行测定2次，将2种方法的结果进行比较，以验证QAMS用于忍冬藤中不同成分含量测定的可靠性，结果见表11。2种方法测得的忍冬藤中各成分含量无明显差异，RSD均小于5%，提示建立的方法具有较好的可信度。

3 讨论

本试验采用双波长模式同时测定忍冬藤中6种化学成分，其中，绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C的检测波长为327 nm，马钱苷的检测波长为236 nm。马钱苷在327 nm波长处无吸收，绿原酸等有机酸虽然在236 nm波长处有吸收，但分离易受忍冬藤中其他环烯醚萜苷类成分的影响，因此，采用双波长模式同时测定，可以克服单一波长测定时信息量不足的缺点，使每个待测成分色谱峰均可以最大峰面积覆盖图谱。目前，QAMS方法多采用单一波长测定中药中同一类成分的含量[9-10]。本研究结果表明，QAMS方法同样适用于双波长模式和多类成分的同时测定。

绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷在忍冬藤中含量较大，生物活性较高，因此将此6种成分作为忍冬藤质量评价的指标。其中，绿原酸化学性质稳定且廉价易得，作为内标物，建立其与咖啡酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、马钱苷的相对校正因子，在不同液相色谱系统与色谱柱中RSD均小于5%，符合测定要求。故选择绿原酸为内标物，以降低检测成本。

本试验采用3套液相色谱系统进行色谱峰定位的重现性考察。虽然在不同色谱仪和不同色谱柱中相对保留时间的RSD均小于5%，但在同一色谱仪中色谱峰定位更为准确。在岛津HPLC仪中，3种色谱柱绿原酸与异绿原酸C相对保留时间的RSD为0.66%，在赛默飞HPLC仪中，3种色谱柱绿原酸与异绿原酸C相对保留时间的RSD为1.36%；在沃特世HPLC仪中，3种色谱柱绿原酸与异绿原酸C相对保留时间的RSD为0.66%。而赛默飞HPLC仪与沃特世HPLC仪计算的RSD为1.94%，3台HPLC仪计算的RSD则达到3.25%。这与3套液相色谱系统流动相的混合方式不同有关，岛津液相色谱系统是二元高压梯度，赛默飞和沃特世液相色谱系统是低压梯度，流动相混合的位置与精度有一定差异，梯度变化时的时间延迟也不相同，从而导致色谱峰定位上的差别。因此，在建立QAMS方法时应注意此问题。

本试验以忍冬藤为研究对象，通过方法学确证、相对校正因子的确认与重现性考察、色谱峰的定位和QAMS准确性评价，对QAMS技术在忍冬藤中的适应性和应用可行性进行研究，结果表明，采用QAMS测得的各成分含量与ESM测定结果没有明显差异，具有较高的重现性、稳定性及可信度。此方法的建立为全面考察忍冬藤质量提供了参考方法，提示在缺少对照品的情况下，通过相对校正因子及色谱峰的定位计算含量，可以实现忍冬藤中6种成分的质量控制。该方法作为忍冬藤质量的一种有效评价方式，可为忍冬藤的质量评价提供参考和依据。

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