大黄素对人宫颈癌裸鼠移植瘤Bcl-2蛋白及其相关X蛋白表达的影响

陶永梅,徐丹,王子一,侯立强,王智

(黑龙江中医药大学附属第二医院药剂科,哈尔滨 150001)

·基础研究·

大黄素对人宫颈癌裸鼠移植瘤Bcl-2蛋白及其相关X蛋白表达的影响

陶永梅,徐丹,王子一,侯立强,王智

(黑龙江中医药大学附属第二医院药剂科,哈尔滨 150001)

目的 观察大黄素对人宫颈癌siha、Hela和C33A细胞株裸鼠移植瘤Bcl-2和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响，探讨其对宫颈癌的作用机制。方法 建立人宫颈癌siha、Hela和C33A裸鼠移植瘤模型，随机分为对照组、大黄素低剂量组和大黄素高剂量组，分别经灌胃给予0.1%二甲基亚砜(DMSO)0.2 mL/只、大黄素20 mg/kg和大黄素40 mg/kg，1 次/d,共14 d。给药结束后处死裸鼠并取瘤组织,采用免疫组织化学法检测Bcl-2和Bax蛋白表达。结果 与相应对照组相比较，随着大黄素剂量增加Bcl-2蛋白表达明显下降，Bax蛋白表达逐渐增高。其中大黄素对siha、Hela两种细胞移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表达的调控作用优于C33A细胞移植瘤。结论 大黄素可能通过下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，诱导肿瘤细胞凋亡，从而起到抑制人宫颈癌裸鼠移植瘤生长的作用。

宫颈肿瘤;大黄素；bcl-X蛋白质;bcl-2相关X蛋白质;小鼠;近交BALB C

宫颈癌是最常见的妇女恶性肿瘤，近年来其发病率居高不下，发病有年轻化趋势。临床研究证明宫颈癌的发生与高危型的人乳头瘤病毒(HPV)感染关系密切，是引发宫颈癌的重要原因之一[1]。在宫颈癌组织中，尤其是高危型HPV16/18 等亚型在宫颈癌组织中检出率达50%～90% ,其感染与宫颈癌的临床进程及预后有关，机体的细胞凋亡调控机制失衡可能参与了宫颈癌的发生和发展进程[2-4]。我们前期研究表明大黄素能明显地抑制人宫颈癌裸鼠移植瘤生长，并呈现出一定的剂量依赖性，而且对siha、Hela两种细胞移植瘤抑制效果优于C33A细胞移植瘤。本研究观察了大黄素对人宫颈癌siha、Hela和C33A细胞株裸鼠移植瘤Bcl-2和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响，进一步探讨其对宫颈癌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 大黄素(美国Sigma 公司)；胎牛血清(四季青公司)；青-链双抗、胰酶和二甲基亚砜(DMSO,碧云天)；RPMI-1640和DMEM低糖培养基(Hyclone公司)；人宫颈癌Siha、HeLa和C33A细胞株(中国科学院上海细胞研究所)；兔抗Bcl-2和Bax多克隆抗体(武汉博士德)；二步法二抗PV6001和DAB显色剂(北京中杉)；其他为国产分分析纯。

1.2 实验动物 清洁级BALB/c/nu雌性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK京2012-0001)，4～6周龄，体质量为18～20 g，饲养条件：SPF级屏障系统的洁净层流架内，室温控制在25 ℃，相对湿度控制为40%～60%。

1.3 细胞培养 三种细胞株培养条件如下：Siha细胞株：RPMI-1640培养基+10%胎牛血清+1%双抗；Hela细胞株：RPMI-1640培养基+10%胎牛血清+1%双抗；C33A细胞株：DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双抗。培养条件：37 ℃、5%的CO2、饱和湿度。使细胞单层贴壁生长，等到70%～80%融合时胰酶消化传代。

1.4 裸鼠皮下移植瘤的建立及给药方案 收集对数生长期的三种细胞Siha、HeLa和C33A,经离心悬浮沉淀后显微镜下计数,并调整细胞悬液浓度和计算活细胞数；在超净工作台内无菌条件下将三种细胞株分别接种于裸鼠右大腿根部皮下，建立A(siha细胞)、B(Hela细胞)和C(C33A细胞)三种细胞移植瘤的模型。

至第15天左右将已移植成功的各模型裸鼠随机分成对照组、低剂量组及高剂量组，每组为6只。大黄素：0.1%的DMSO为溶剂，分别配制成0.2% 和0.4%的浓度，待用于裸鼠灌胃给药。三组裸鼠实验组分别经灌胃给予0.1%二甲基亚砜(DMSO)0.2 mL/只、大黄素20 mg/kg以及大黄素40 mg/kg，每日给药1次,如此连续14 d。

1.5 免疫组织化学检测 给药结束后处死裸鼠,剥离肿瘤组织置于4%多聚甲醛中固定，常规脱水后石蜡包埋，切片进行免疫组织化学检测，严格按试剂盒说明书进行操作。

Motic3000显微摄影系统于400倍下摄片，采用Image-pro plus6.0病理图像分析系统对阳性表达进行定量分析，以积分吸光度(IOD) 代表蛋白相对表达量，积分吸光度(IOD)=阳性面积×平均吸光度，每组随机分析6个高倍镜视野。染色结果细胞核呈蓝色，阳性表达为黄色或黄棕色。

1.6 统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件进行方差分析,组间比较t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大黄素对人宫颈癌Siha细胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 与对照组相比，大黄素低剂量和高剂量组Bcl-2蛋白表达有不同程度的降低，Bax蛋白表达有不同程度的增高，见表1。

表1 各组人宫颈癌Siha细胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表达

注：与对照组比较,aP<0.01

2.2 大黄素对人宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 与对照组相比，大黄素低剂量和高剂量组Bcl-2蛋白表达有不同程度的降低，Bax蛋白表达有不同程度的增高，见表2。

表2 各组人宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表达

注：与对照组比较,aP<0.01

2.3 大黄素对人宫颈癌C33A细胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 与对照组相比，大黄素低剂量和高剂量组Bcl-2蛋白表达有不同程度的降低，Bax蛋白表达有不同程度的增高，见表3。

表3 各组人宫颈癌C33A细胞裸鼠移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表达

注：与对照组比较,aP<0.01,bP<0.05

3 讨论

肿瘤的发病与细胞凋亡失衡关系密切[5],研究显示Bcl-2/Bax 在宫颈癌组织中存在异常表达[2-4]。细胞凋亡是机体中细胞在生长发育过程中发生的一种程序性死亡，涉及复杂的生理和病理过程,对机体起着极其重要的调控作用。Bcl-2 家族基因是细胞凋亡的重要调控因素之一,其中Bcl-2可以抑制细胞凋亡,Bax 是Bcl-2 的同源基因,可拮抗Bcl-2使细胞趋于凋亡[6-7]。

大黄素是一种蒽醌类化合物，是中药大黄等的主要有效成分，研究表明其具有很好的抗肿瘤作用，体外可抑制胰腺癌、卵巢癌、肺癌和白血病等多种恶性肿瘤细胞生长[8]。我们前期研究结果表明：大黄素能显著抑制siha、Hela和C33A三种人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的瘤重、生长体积，对siha和Hela细胞移植瘤作用更为明显，且呈一定的剂量依赖性。本研究结果表明:与相应对照组相比较，随着大黄素剂量增加Bcl-2蛋白表达明显下降，Bax蛋白表达逐渐增高。其中大黄素对siha、Hela两种细胞移植瘤Bcl-2和Bax蛋白表达的调控作用优于C33A细胞移植瘤。因此我们推测，大黄素可能通过下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，诱导肿瘤细胞凋亡，从而起到抑制人宫颈癌裸鼠移植瘤生长的作用。

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黑龙江省教育厅科学技术研究(面上)项目(12541757)

陶永梅，副主任药师，Email:taoyongmei72@163.com

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10.3969/J.issn.1672-6790.2015.02.024

2015-01-12)