坎地沙坦对自发性高血压大鼠骨骼肌核转录因子-2表达和胰岛素敏感性的影响

李凡，谢静，郝华，黄慧，曾强

(解放军总医院国际医学中心, 北京 100853)

·基础研究·

坎地沙坦对自发性高血压大鼠骨骼肌核转录因子-2表达和胰岛素敏感性的影响

李凡，谢静，郝华，黄慧，曾强

(解放军总医院国际医学中心, 北京 100853)

目的 研究坎地沙坦对自发性高血压大鼠骨骼肌核转录因子-2(Nrf2)表达和胰岛素敏感性的影响。方法 30只自发性高血压大鼠随机分为对照组(C组)、模型组(M组)、坎地沙坦低剂量组(Can1组)、坎地沙坦高剂量组(Can2组)，10只WKY大鼠作为对照组，均给予果糖喂养，Can1组及Can2组分别给予坎地沙坦(0.4 mg/kg、0.8 mg/kg)灌胃干预。实验第8周末，检测各组大鼠胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、活性氧(ROS)以及Nrf2的表达水平。结果 与C 组相比，M组HOMA-IR水平及ROS表达显著升高，而Nrf2表达降低，差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)；与M组相比，Can2组的ROS生成减少，HOMA-IR下降，差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)；Can1及Can2组的Nrf2表达均较M组显著增加，差异有统计学意义(P<0.05 、P<0.01)。结论 坎地沙坦可以通过拮抗AngⅡ减轻AngⅡ诱导的骨骼肌胰岛素抵抗和氧化应激。

高血压；血管紧张素Ⅱ；胰岛素抗体；活性氧；大鼠, 近交SHR

胰岛素抵抗(IR)是指机体对胰岛素的敏感性下降，导致细胞摄取和利用葡萄糖的效率降低的状态，是高血压与2型糖尿病的共同病理生理学基础[1]。目前，临床试验证实，血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)可改善高血压患者的IR，从而降低该人群的2型糖尿病发病率[2-3]。ARB的这种作用部分源于对于细胞内活性氧(ROS)的抑制[4]。核转录因子-2(Nrf2)是调控细胞内抗氧化反应元件的关键因子，它能抑制内源性ROS的过度表达[5]，但目前尚不十分清楚ARB是否通过Nrf2发挥抗氧化作用。本研究建立自发性高血压(SHR)大鼠胰岛素抵抗的动物模型，通过检测坎地沙坦对其骨骼肌胰岛素敏感性的影响，以及骨骼肌细胞内Nrf2和ROS的改变，进一步探讨坎地沙坦改善骨骼肌细胞胰岛素抵抗的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组 30只12周龄的清洁级雄性SHR大鼠，体质量为(245.6±23.5)g，10只12周龄的清洁级雄性WKY大鼠，体质量为(250.9±21.7)g，均购自北京维通利华实验动物中心，许可证号SCXK(京)2007-0001。所有大鼠适应性喂养1周后，将30只SHR大鼠随机分为模型组(M组)、坎地沙坦低剂量组(Can1组)、坎地沙坦高剂量组(Can2组)，每组10只，另外10只WKY大鼠作为对照组(C组)。

1.2 主要药物及试剂 坎地沙坦西酯购自天津武田制药有限公司生产，批号：024A；大鼠胰岛素检测试剂盒购自LINCON公司；血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；ROS检测试剂盒购自R&D systems公司；DEPC.H2O、Prime ScriptTMRT试剂盒、SYBR Premix TaqTMⅡ均购自TaKaRa公司；Nrf2抗体、山羊抗鼠IgG-HRP购自SANTA CRUZ公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型及药物干预 各组大鼠均给予标准大鼠饲料喂养。同时，将果糖结晶溶于饮用水中，配置10%浓度的果糖溶液，各组大鼠均自由饮用，以诱导胰岛素抵抗产生。Can1组及Can2组每日给予坎地沙坦西酯灌胃，剂量分别为0.4 mg/kg和0.8 mg/kg，M组及C组灌服等容量纯净水，每日1次，连续给药8周。

1.3.2 血清学指标检测 第8周末，各组动物空腹12 h后断头处死并采集血液标本。4 ℃低温3000 r/min,15 min分离血清，分别送检空腹血糖(FBG)、AngⅡ及空腹血清胰岛素(FIns)，以上检测指标均按试剂盒说明方法进行。

1.3.3 骨骼肌标本收集及处理 大鼠断头处死后，离断双下肢，迅速剪开皮肤，在冰盘上分离股四头肌，去除肌肉表面脂肪并于冰0.9%氯化钠溶液中洗净血液，用滤纸吸干水分后称重，加入一定量的PBS液，再放入液氮中冷冻。在进行骨骼肌ROS含量测定、荧光定量PCR及Western blot实验时，随机切取股四头肌组织(0.2～0.4 g)称重后加入蒸馏水，在水浴中用匀浆器制备1∶10的匀浆，3000 r/min,10 min后取上清液作为待测样本。

1.3.4 ROS含量测定 取一定量的骨骼肌匀浆上清，采用ELISA法，按照试剂盒说明步骤操作，显色后终止反应，用酶标仪在450 nm波长下测量吸光度(OD值)。以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用标准物的浓度与OD值绘制出标准曲线的直线回归公式，将待测样本的OD值代入公式，计算出待测样本的浓度，再乘以稀释倍数，即为最终待测样本ROS含量值。

1.3.5 Western blot检测 从待测样本中提取蛋白质，BCA测试盒测定各组蛋白质浓度。各组取相同质量的蛋白，变性后在聚丙烯酰胺凝胶上样进行电泳，电泳完毕后，将蛋白转移到PVDF膜上，目的蛋白Nrf2使用5%BSA封闭，内参蛋白GAPDH使用5%脱脂奶粉封闭，加入Nrf2(1∶500)及GAPDH(1∶1000)多克隆抗体，4℃过夜。TBST洗涤6次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗鼠IgG)孵育，ECL显色，X光片记录结果，扫描蛋白条带的密度并进行分析。以内参蛋白GAPDH的密度为基准值1，对比得到各组样本Nrf2蛋白的表达量。

1.4 统计学处理 通过SPSS12.0统计软件对各组实验数据进行ANOVA方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 坎地沙坦对SHR的AngⅡ、FBG、FIns及HOMA-IR的影响 结果显示，实验第8周时，模型组大鼠的FIns及HOMA-IR均较对照组明显升高(P<0.01)，而坎地沙坦低剂量组及高剂量组大鼠FIns、HOMA-IR均较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.01、P<0.05)。与模型组相比，坎地沙坦低剂量组及高剂量组AngⅡ水平有升高趋势，其中坎地沙坦高剂量组出现差异有统计学意义(P<0.05)。各组大鼠之间FBG水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 坎地沙坦对SHR骨骼肌ROS的影响 与对照组比较，模型组大鼠骨骼肌ROS含量明显增加(P<0.01)；与模型组比较，坎地沙坦低剂量组及高剂量组大鼠骨骼肌ROS均下降，见图1。

2.3 AngⅡ和坎地沙坦对Nrf2 蛋白表达的影响 结果显示，与对照组相比，模型组大鼠的Nrf2蛋白表达量显著降低(P<0.01)；与模型组相比，坎地沙坦低剂量组及高剂量组的Nrf2蛋白表达量有升高趋势，且差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)，见图2，3。

表1 坎地沙坦对SHR血清AngⅡ、FBG、FIns及HOMA-IR的影响

注：C组：对照组,M组：模型组,Can1组：坎地沙坦低剂量组,Can2组：坎地沙坦高剂量组；与C组比较,cP<0.05，bP<0.01;与M组比较,aP<0.05，dP<0.01

3 讨论

SHR源于WKY大鼠，是经人工多代筛选的遗传性高血压大鼠，随着年龄增加，其高血压的发生率几乎为100%。同时，通过果糖诱导，还可以出现胰岛素抵抗和糖耐量异常及脂质代谢紊乱。实验第8周时，模型组大鼠出现了明显的FIns及HOMA-IR升高，结果提示该动物模型具有明确的胰岛素抵抗的病理生理特征，达到了我们实验设计的目标。

近年来，随着对活性氧族研究的深入，证实了大量ROS的产生是导致细胞氧化应激损伤的重要机制之一，而氧化应激损害在形成胰岛素抵抗的病理生理过程中起重要作用[6]。有研究表明，对于高血压的个体，细胞内抗氧化系统的分子信号反应能力下降，则只会加重ROS对胰岛素信号通路的损害，产生胰岛素抵抗。本研究中，观察到模型组大鼠骨骼肌内内ROS表达显著增加，同时HOMA-IR也显著增加，提示该组大鼠出现了胰岛素抵抗；而给予坎地沙坦干预的大鼠，由于抑制了AngⅡ的作用，ROS表达下降，HOMA-IR也相应下降，胰岛素抵抗得到改善。因此，我们认为高血压个体中，肾素-血管紧张素系统过度激活提高了AngⅡ的水平，这在一定程度上影响了骨骼肌细胞内的氧化应激平衡，增加了内源性ROS的产生，其原因可能与AngⅡ增加细胞内NAD(P)H氧化酶表达有关[7]。

Nrf2是细胞抗内源性氧化应激的重要中枢调节者，在细胞介导的抗氧化应激防御反应中具有重要的作用[8]，因此，高血压状态下细胞抗氧化能力下降，以及由此产生的胰岛素信号通路损害，很可能与Nrf2的功能异常有关。

本研究表明，模型组大鼠AngⅡ表达增加会抑制骨骼肌细胞内的Nrf2的表达，从而使ROS生成增加，骨骼肌胰岛素敏感性下降。给予坎地沙坦干预后，由于抑制了AngⅡ，骨骼肌细胞内Nrt2的表达增加，ROS的水平下降，胰岛素抵抗得到改善。提示坎地沙坦通过对AngⅡ的抑制上调了Nrf2的表达，继而通过Nrf2/ARE途径发挥对抗氧化应激的作用，使细胞内ROS有所降低，恢复和改善了由于ROS过度增加而损害的胰岛素信号传导途径，从而使胰岛素能发挥正常的促进细胞摄取葡萄糖的功能。综上所述，坎地沙坦对SHR骨骼肌胰岛素敏感性的保护机制部分来源于减少AngⅡ对Nrf2表达的抑制作用。

(本文图1～3见插图2-1)

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Effects of candesartan on the expression of Nrf2 and insulin sensitivity in the spontaneous hypertension rats

Li Fan,Xie Jing,Hao Hua,Huang Hui,Zeng Qiang

(International Medical Center,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China)Corresponding author:Zeng Qiang,Email:zq301@126.com

Objective To investigate the effects of candesartan on the expression of Nrf2 and insulin sensitivity of the spontaneously hypertensive rats(SHR)and its possible mechanism.Methods 30 SHR were randomly divided into model group,low dose group and high dose group.10 WKY rats served as control group.All the rats fed with fructose,while the low and high dose group rats accepted candesartan consecutive treatment with the dose of 0.4 mg/kg and 0.8 mg/kg respectively.At the 8th weekend,the insulin resistance index(HOMA-IR),the level of reactive oxygen species(ROS)and the expression of Nrf2 were detected.Results Compared with the control group,the HOMA-IR was significantly increased in the model group(P<0.05),the protein expression of Nrf2 in model group significantly decreased(P<0.01)at the same time while the level of ROS increased significantly(P<0.01).Compared with the model group,the HOMA-IR decreased obviously in the high dose group (P<0.01).The protein expression of Nrf2 in the low dose and high dose group increased significantly (P<0.01,P<0.05) compared with model group,and the level of ROS significantly decreased compared with the model group(P<0.05).Conclusion Candesartan could improve the insulin resistance and oxidative stress by the antagnism effect of AngⅡ in the skeletal muscle cells.

Hypertension;AngiotensinⅡ;Insulin antibodies;Reactive oxygen species;Rats,Inbred SHR

北京市自然科学基金项目(7122171)

李凡，主治医师，Email:lifan76@126.com

曾强，研究员，教授,Email:zq301@126.com

R544.1

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2015.02.023

2015-01-26)