寒温并用方对IL-1β诱导INS-1细胞凋亡的影响

刘树林，李赛美 ，李小兵，凌 燕，吕冰清

(广州中医药大学第一附属医院，广州 510405)



寒温并用方对IL-1β诱导INS-1细胞凋亡的影响

刘树林，李赛美*，李小兵，凌 燕，吕冰清

(广州中医药大学第一附属医院，广州 510405)

目的 用细胞模型探讨IL-1β诱导INS-1细胞凋亡，并观察寒温并用方对其保护作用。方法 MTT观察寒温并用方(1、0.5、0.25、0.125 g/L) 分别作用24、48、72 h对INS-1细胞增殖的影响。寒温并用方(1、0.5、0.25、0.125 g/L) 预处理细胞12 h，50 ng/L IL-1β继续处理细胞24 h，同时设空白对照组，IL-1β处理组。Annexin V-FITC流式细胞仪检测细胞凋亡情况。Western blotting检测各组caspase3，bcl-2 Bax蛋白表达。结果 MTT显示寒温并用方以时间剂量依赖性促进INS-1细胞增殖。但1 g/L浓度在作用72 h后与其他浓度比较，显示明显的细胞抑制作用。AnnexinV-FITC/PI结果显示IL-1β促进细胞凋亡。Western blotting 结果表明IL-1β促进细胞凋亡蛋白合成，寒温并用方抑制其表达。结论 寒温并用方能促进INS-1细胞增殖，并抑制IL-1β诱导INS-1的凋亡，可以用于炎症性胰岛细胞受损糖尿病的预防及治疗。

寒温并用方；IL-1β；INS-1；糖尿病

2型糖尿病(T2DM)胰岛素抵抗与胰岛β细胞功能异常的可能机制包括氧化应激、内质网应激、胰岛淀粉样变性、肌肉与肝脏及胰腺部位异位脂肪沉积、脂毒性以及糖毒性等[1]。上述机制均被认为某种炎症反应。在炎症相关T2DM患者体内可以检测到组织炎症，且伴有细胞因子与趋化因子水平的升高。动物模型与人体研究发现，T2DM伴有胰岛的炎症细胞浸润[2]。T2DM患者的胰岛组织切片显示纤维化与淀粉样沉积，从而给胰岛的炎症反应提供了证据[3]。中医认为2型糖尿病与消渴病类似，其发生发展与“脾”的运化功能关系密切，2型糖尿病患者多食肥甘、运动量少等生活方式对脾胃的运化功能影响极大，脾气亏虚则水谷不化精微而生痰湿，久则湿郁化热，故脾阳气虚、湿热内盛是早期2型糖尿病的主要病机。李赛美教授临床使用经方葛根芩连汤合理中丸(暂定名为寒温并用方)寒温并用治疗2型糖尿病，临床观察对改善患者症状、降低血糖及改善胰岛素抵抗均有较好疗效。本研究利用IL-1β诱导大鼠胰岛素细胞(INS-1)炎症样模型，观察寒温并用中药复方对其影响，探讨寒温并用方治疗2型糖尿病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 MTT检测试剂盒(广州市杏海生物 Ginbio)，RPMI 1640完全培养基(Gibco)，IL-1β(peprotech)，胎牛血清(杭州四季青20110628),AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(碧云天C1063)，Caspase-3(武汉博士德)，Bcl-2、Bax(CST),兔抗小鼠二抗(武汉博士德)，western blotting检测试剂盒(广州市杏海生物Ginbio)，其余试剂为分析纯。酶标仪(bio-tek 美国)，电泳电转系统(美国bio-rad)，倒置显微镜(广州粤显)，激光共聚焦(Leica)，细胞培养箱(Thermo Fisher)。寒温并用方：葛根40 g，黄连15 g，黄芩15 g，炙甘草15 g，人参15 g，白术15 g，干姜15 g。(以此比例进行配药)。用纯水浸泡4 h以上，煎煮，重复1次，合并煎煮液。浓缩，采用低温减压干燥技术制备处方浸出物粉末，最终获得16.36 g粉末，后续实验用含血清培养基配制使用药物浓度。

细胞培养：INS-1(大鼠胰岛素细胞)，购买于中科院上海细胞库。加入含100 mL/L胎牛血清RPMI 1640完全培养基，单层培养和孵化于5% CO2培养箱中，37 ℃条件下培养。高糖培养葡萄糖浓度为20 mmol/L。

1.2 实验分组 实验分为对照组，IL-1β组，寒温并用方处理组(1、0.5、0.25、0.125 g/L)

1.3 指标检测

1.3.1 MTT检测中药复方对INS-1的增殖影响 调整细胞浓度为5.0×103cell/mL， 接种于96孔板中，每孔100 μL，分为1、0.5、0.25、0.125 g/L、对照组(不加药)。 每组设5个平行孔，并设空白组(不加细胞，只加不含药血清培养基)。放置37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱过夜，待细胞贴壁后，吸取培养基，用高压灭菌的PBS洗细胞一遍，含药组加入100 μL不同含药浓度血清的完全培养基,用药后37 ℃，5% CO2饱和湿度再培养24 h。吸除培养液，加入无血清新鲜培养液。然后每孔加入MTT(5 g/L)15 μL，微量振荡器震荡1～2 min，培养箱中反应4 h。小心吸除培养基，尽量不要触及孔底的结晶。每孔加入DMSO 150 μL，摇床上摇动10 min，选择490 nm作为测定波长，630 nm为参比波长，以空白组调零，在酶标免疫测定仪上测定各孔的吸光度。

1.3.2 流式细胞仪观察细胞凋亡 消化对数生长期细胞，调整细胞密度5×106/ mL。六孔板每孔加1 mL细胞悬浮液，过夜贴壁生长。不同药物浓度预孵育4 h。对照组除外，其余组加IL-1β，使其浓度为50 ng/mL。24 h后除去细胞培养液，胰酶消化，收集细胞，用PBS洗细胞3次，按Annexin V-FITC 试剂盒操作，然后上流式细胞仪上检测，分析凋亡细胞比例。

1.3.3 Western blotting检测Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白影响 按照凋亡细胞检测方法处理细胞。收集实验各组INS-1细胞，提取总蛋白并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取25 μg总蛋白，8%分离胶和4%浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；然后将蛋白质电转移至孔径0.45 μm PVDF膜；取出含目的蛋白的膜，用含5%脱脂奶粉的PBST封闭1 h；加入一抗4 ℃过夜； PBST洗涤10 min，3次；再加入HRP标记的羊抗兔或鼠二抗(均1:10 000)， 孵育2 h；PBST洗涤10 min，3次；用ECL化学发光底物显影，胶片定影。图片用 Image-Pro Plus 6.0软件进行光密度值分析，以GAPDH 为内参对照。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行分析，不同时点各组INS-1比较，采用两因素混合设计重复测量数据的方差分析；多组之间细胞凋亡率、Bcl-2、caspase-3和Bax均数比较，采用单因素方差分析，采用LSD法(方差齐时)或Dunnett’s T3(方差不齐时)进行组间均数的多重比较。

2 结果

2.1 寒温并用方促进INS-1细胞增殖 我们观察了72 h内0.125～1 g/L药物处理INS-1细胞。结果显示1 g/L作用24、48 h，促进INS-1细胞增殖(P<0.05)，其中1 g/L在72 h后显示细胞毒性，抑制细胞增殖。48 h后0.25、0.5 g/L寒温并用方促进细胞增殖(P<0.05)。结果见表1。根据MTT结果，选择0.125、0.25、0.5 g/L3个浓度进行后续实验。

表1 寒温并用方对INS-1细胞增殖的影响

注：与对照组比较，#P<0.05；与24 h比较，△P<0.05

2.2 寒温并用方能够抑制IL-1β诱导的INS-1细胞凋亡

2.2.1 流式细胞仪AnnexinV-FITC检测细胞凋亡影响 与对照组比较，IL-1β诱导细胞凋亡，凋亡率为(24.1±0.69)%(P<0.05)，与IL-1β处理组比较，0.5、0.25 g/L处理组抑制IL-1β诱导的INS-1细胞凋亡(P<0.05)，见表2。

组 别凋亡率/%对照组6．73±1．78#IL⁃1β24．10±0．69 寒温并用方0．125g/L20．23±1．96 寒温并用方0．25g/L14．47±1．03#寒温并用方0．5g/L6．67±0．61#

注：与IL-1β组比较，#P<0.05

2.2.2 Western blotting检测凋亡蛋白的影响 实验结果表明，与对照组比较，IL-1β组Bcl-2微弱表达，但caspase3、Bax 高表达(P<0.05)。与IL-1β处理组比较，药物处理组剂量性提高凋亡抑制蛋白Bcl-2表达，同时凋亡蛋白caspase3、Bax被抑制(P<0.05)。见表3。

表3 寒温并用方对凋亡蛋白表达的影响 ±s)

注：与IL-1β组比较，#P<0.05

3 讨论

近年来，IL-1β在糖尿病患者病理过程作用受到研究者重视。1型糖尿病主要是由于单核细胞入侵细胞，产生大量的细胞因子IL-1β等引起细胞数量与功能极大下降；而2型糖尿病是受饮食或者遗传的因素，导致产生胰岛素抵抗，引起体内血糖的升高，进而产生大量的IL-1β，引起细胞功能失调。由此可见，IL-1β在介导1型与2型糖尿病中均发挥重要作用[4]。Bcl-2家族是细胞凋亡的关键调节分子，由Bcl-2亚家族、Bax亚家族和BH3亚家族组成。高血糖、游离脂肪酸、胰岛素等可诱导2型糖尿病β细胞凋亡。Bcl-2家族成员接受诱导凋亡信号后，形成一个复杂的相互作用网络，调节胰岛β细胞凋亡[5]。Caspase 3在细胞凋亡中剪切抗凋亡蛋白Bcl-2，发挥促凋亡作用[6]。一些研究[7-10]证明，中药及中药复方制剂具有减少胰岛β细胞的凋亡、增强胰岛细胞活性等作用，并且能够上调Bcl-2基因的表达,下调Bax基因表达。

中医认为2型糖尿病发病与脾胃功能关系密切，有研究者[11]通过流行病学调查发现，糖尿病患者临床多存在疲倦、多食口干、大便不畅等症状，认为其发病机理为脾虚、胃热。李肇翚等[12]对汉唐以来治疗消渴病的300余首方剂进行分析发现，调理脾胃的中药达一半以上。我们在临床中发现，2型糖尿病患者，尤其是糖尿病前期及早期2型糖尿病患者多存在胃热脾寒病机，临床中以葛根芩连汤合理中汤寒温并用进行治疗，取得较好疗效。葛根芩连汤治疗糖尿病临床及实验研究较多，一般认为方中黄连的主要成分小檗碱降糖作用较为确切，如有研究[13]表明，小檗碱可以通过提高葡萄糖转运蛋白4(GLUT-4)的水平等途径改善胰岛素抵抗从而降低血糖。另有一些研究[14-16]表明，小檗碱能够调节胰岛β细胞功能，认为可以通过刺激胰岛素及胰高血糖素等途径降低血糖。对葛根芩连汤全方的实验及临床研究均表明该方具有明确的调节糖代谢、脂代谢、改善胰岛素抵抗及改善氧化应激等作用[17-19]。单纯使用理中汤治疗糖尿病的报道较少，但张智勇[20]曾观察23例以附子理中汤治疗的2型糖尿病患者，结果表明辨证使用附子理中汤治疗2型糖尿病疗效显著。

李赛美教授认为，2型糖尿病的基本病机为虚实挟杂、寒热错杂，邪实主要为湿热浊毒，正虚主要为脾肾亏虚。在疾病发生发展的不同阶段虚实病机之间的关系表现不同，如疾病早期，尤其血糖较高未控制时患者多以湿热浊毒等邪实为主，脾肾亏虚为次；而经过治疗以后，患者湿热浊毒等邪实得到祛除，则以脾肾亏虚等正虚为主。但无论哪个阶段都需要注意两虚实方面的病机的存在。临床常以经方葛根芩连汤合理中丸加味治疗，根据患者邪正的对比关系增减药量。而且认为单纯的使用寒凉药虽能取得一时血糖的降低，但易损伤先后天之本，对远期治疗不利；反之，若只以温阳散寒祛湿等温热药治疗，则对湿热浊毒之邪的祛除不利，临床表现为血糖极难控制。故在临床中以两方合用，寒温同治，取得较好的疗效。

实验结果表明寒温并用方可能通过抑制凋亡蛋白caspase-3、Bax的表达，并提高凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，从而起到抑制胰岛细胞凋亡的作用；而且寒温并用方呈剂量及时间依赖性的促进INS-1细胞增殖。

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Hanwenbingyong prescription inhibited IL-1β-induced apoptosis in INS-1

LIU Shulin,LI Saimei*,LI Xiaobing,LING Yan,LYU Bingqing

(First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China)

Objective To investigate cellular model IL-1β-induced apoptosis in INS-1 cells,and observe the protective effect of Hanwenbingyong prescription.Methods The effects of Hanwenbingyong prescription (1,0.5,0.25,0.125 g/L) on proliferation of INS-1 cell were observed by MTT after acting 24,48 and 72 h.Hanwenbingyong prescription (1,0.5,0.25,0.125 g/L) pretreated cell for 12 h,and then 50 ng/L IL-1β-treated cells continue to 24 h.At the same time,made control group and IL-1β treatment group.Apoptosis was detected by V-FITC Annexin flow cytometry.Expression of Caspase3 and Bax Bcl-2 was detected by Western blotting.Results MTT showed Hanwenbingyong prescription promoted proliferation of INS-1 cells with a time and dose dependence.But the cells of 1g/L concentration were better than other groups after effected 72h.AnnexinV-FITC/PI showed that IL-1β promoted apoptosis.Western blotting showed that IL-1β promoted apoptosis protein synthesis,Hanwenbingyong prescription inhibited expression of IL-1β.Conclusion Hanwenbingyong prescription can promote proliferation of INS-1 cells,and inhibit the apoptosis of INS-1 induced by IL-1β,which can be used in prevention and treatment of inflammatory islet cell damage.

Hanwenbingyong prescription; IL-1β; INS-1; diabetes

10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.12.025

广东省中医药局科研课题基金资助项目(20131168)。

刘树林(1979-)，男，主治医师，博士，从事内分泌疾病的中西医结合治疗与研究。

R259

A

1003-5699(2015)12-1268-04

赵玉芝

2015-07-08)

*通信作者：李赛美，博士，教授，电子信箱-Lisaimei2004@163.com