外燥对小鼠气道免疫及分泌功能的影响研究

胡利群，丁建中，刘国平.武汉市新洲区疾病预防控制中心，湖北武汉　430040；.长江大学，湖北荆州　43405

外燥对小鼠气道免疫及分泌功能的影响研究

胡利群1，丁建中2，刘国平2
1.武汉市新洲区疾病预防控制中心，湖北武汉430040；2.长江大学，湖北荆州434025

[摘要]目的探讨外燥对昆明种小鼠呼吸道的局部免疫及分泌功能的影响，研究外燥致病的病机。方法该实验自2009年10月—2010年5月完成。将120只SPF级昆明种小鼠随机分为温燥组，常温燥组，常温常湿组，凉燥组等4组，每组30只。在第六、十二、十八天处理后，对各组气道灌洗液中黏多糖，SIgA和IgG等指标进行检测。结果黏多糖含量在温燥组第十二、十八天降低；凉燥组则第十二天最低（P <0.05）。温燥组第六到十八天，SIgA含量持续下降。IgG含量第六到十八天温燥组和常温燥组持续下降，且温燥组下降更显著。结论外燥可导致肺卫失衡、肺津液生成减少、呼吸道的“纤毛-黏液毯”的免疫屏障功能；减弱，为研究外燥伤肺提供实验基础资料。

[关键词]外燥气道；免疫功能；分泌功能

燥邪为六气之变。外感六气之一中的外燥,是一种非常重要的致病因素。其产生主要与温度及相对湿度相关。因寒热相兼的不同,外燥有凉燥和温燥之分，两者基本病机都为“燥胜则干”[1]。“燥在上，必乘肺。肺者，…通于秋气。”和“燥胜则干”等中医经典理论都指出燥邪特点形成与时令有关[2]。六淫犯肺的实质是诸邪与体内微观物质相互作用的异常表现形式[3]。

气道黏膜分泌的气道液主要成分为黏多糖和蛋白质。其覆盖于气管黏膜表面形成黏液毯，可参与“纤毛－黏液毯”局部免疫屏障。一方面，可以润湿气道黏膜表面，另外，也能保护上皮纤毛的运动。大量的黏液难以排出而储留于气管腔并形成黏液栓，可导致或加重气道阻塞、病原菌易定植，抗生素难以渗入并在细菌驻留的黏液中达到杀菌浓度而导致反复感染和诱发细菌耐药性[4]。检测黏多糖可作为监测气道腺体分泌功能的量化指标[5]。

现代医学证实，体液中的小分子物质如抗体、细胞因子等起着重要的免疫防御作用，与机体“正气内存，邪不可干”相关。在外燥致肺部炎性病理改变的基础上，该实验自2009年10月—2010年5月完成，将120只SPF级昆明种小鼠随机分为温燥组，常温燥组，常温常湿组，凉燥组等4组，每组30只。在第六、十二、十八处理后，对各组气道灌洗液中黏多糖，SIgA和IgG等指标进行检测。观察外燥对昆明种小鼠呼吸道的局部免疫及分泌功能的影响，为研究外燥病机提供实验基础资料。

1　资料与方法

1.1一般资料及分组情况

1.1.1动物该实验自2009年10月—2010年5月完成。无特定病原体级昆明种小鼠120只，雌雄各半，体重（17±1）g。由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号:SCXK(鄂) 2008－2005。

1.1.2主要仪器和试剂LG风扇程控仪，LRH-250人工智能气候箱，BEP-Ⅲ酶标仪。咔唑，小鼠IgG单克隆抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)定量试剂盒,小鼠分泌型免疫球蛋白A(SIgA)ELISA试剂盒。

1.1.3动物分组与造模将小鼠随机分为温燥组，常温常湿组、常温燥组和凉燥组等四组，每组30只，按文献造模[6]，于人工智能气候箱内常规饲养。第六、十二、十八天处理后，检测相关项目。

1.2实验方法及观察指标

1.2.1呼吸道液黏多糖（RS）测定(ng/mL)采用咔唑比色法检测。标本：将各组实验小鼠断颈处死，暴露气管，常规气管插管，将37℃生理盐水1 mL缓慢推注气管，回抽，重复2次，离心取上清液当天检测RS。主要步骤:取50 μL标本稀释5倍稀释，加四硼酸硫酸钠溶液2.5 mL，置沸水中10 min，取出冷却至室温后，加100 μl咔唑液后再置沸水中15 min，取出冷却至室温后，用紫外分光光度计测定OD值。用3 mmol/L氯化钠稀释D-葡萄糖醛酸内酯储存液成25～300 ug/mL并制作工作曲线（n=8,r=0.8992）。每份标本重复测定2次，

1.2.2SIgA和IgG通过标准曲线求出标本中含量。检测采用ABC-ELISA试剂盒法。标本来源同1.2.1。利用自动酶标仪495nm测定OD值，以包被液作空白对照，PBS pH7.4（10%小牛血清）作阴性对照。依标准曲线求其含量。

1.3统计分析

2　结果

2.1外燥对小鼠气道液黏多糖的影响

与正常的常温常湿组比较，温燥组第六天RS升高，但第十二、第十八天持续明显下降；常温燥组第六至第十八天RS持续升高；凉燥组则是第六天略升高-第十二天最低（P <0.05）-第十八天再升高。见表1。

表1　外燥对小鼠气道液黏多糖的影响(±s)

表1　外燥对小鼠气道液黏多糖的影响(±s)

注：与常温燥组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。组内比较第六天与第十二天比较，●P＜0.01；第六天与第十八天比较,＃P＜0.05。第十二天与第十八天比较,△P＜0.01。

温燥组（n=10）常温燥组（n=10）常温常湿组（n=10）凉燥组（n=10）组别313.98±138.68 409.21±217.87 281.48±106.71 298.78±35.56 (236.51±41.55)*294.54±62.32 270.97±66.71 (202.98±22.85)**●(187.75±64.17)**＃321.01±66.76 (227.75±66.35)**(275.02±38.39)△气道液黏多糖（μg/ml）第六天　第十二天　第十八天

2.2外燥对小鼠气道液IgG，SIgA的影响

常温常湿组第六、第十二、第十八天气道液中SIgA含量稳定。常温燥组第六到十八天SIgA变化不明显，温燥组第六、第十二、第十八天SIgA持续下降，以第十二、第十八天为重(P﹤0.05),同组比较：只有凉燥组第六、第十二天改变不明显,第十八天出现升高。

表2　外燥对小鼠气道夜SIgA的影响（±s）

表2　外燥对小鼠气道夜SIgA的影响（±s）

注：与常温常湿比较,**P﹤0.01；组内第六天与第十八比较＃P﹤0.05。

温燥组（n=10）常温燥组（n=10）常温常湿组（n=10）凉燥组（n=10）组别71.58±30.56 67.36±25.87 73.35±14.84 66.07±26.89 （46.78±23.82）**90.78±35.66 74.42±13.29 72.46±21.09 （47.81±26.31）**88.61±22.68 78.75±14.67 （100.09±40.20）＃SIg-A浓度含量（ng/ml）第六天　第十二天　第十八天

表3显示，常温常湿组第六、第十二、第十八天气道液中IgG含量相对稳定。与常温常湿组比较，常温燥组、温燥组IgG第六、第十二、第十八天持续在常温常湿组、常温燥组、温燥组中下降，以和天为甚（P﹤0.05），凉燥组第六、第十二天下降明显，但第十八天含量略升高但无统计学意义。

表3　外燥对小鼠气道液IgG的影响（±s）

表3　外燥对小鼠气道液IgG的影响（±s）

温燥组（n=10）常温燥组（n=10）常温常湿组（n=10）凉燥组（n=10）组别（92.06±28.63）**（140.45±40.26）*198.18±26.28 （137.88±45.14）*112.87±30.81 105.45±36.81 168.79±62.32 130.89±78.32 93.56±21.68 （94.32±43.59）＃（138.40±43.54）＃＃164.79±69.89 IgG（ng/ml）第六天　第十二天　第十八天

注：与常温常湿组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01;第六天与第十八天比较, ＃P＜0.05，＃＃P＜0.013。

3　讨论

外感燥邪，既有外感病的一般临床表现，又有燥邪伤犯肺系，耗伤津液的症状[7]。黏膜上皮及腺体分泌的双层液体构成气道黏液，其成分以黏蛋白为主，由黏多糖和蛋白质组成[8]。肺津液生成减少，可导致组织细胞形态结构的改变及功能受损[9]。以表1中模拟外燥条件资料显示，温燥组第六，第十二天黏多糖含量明显减少。表明外燥可致气道黏液分泌减弱，使纤毛上皮失去气道黏液的保护作用，气道“纤毛-黏液毯”防御功能受损。气道炎性病邪之物滞凝为黏稠之痰而难以被气道“纤毛-黏液毯”排出，或聚集于肺泡与肺泡外间质引起肺水肿、瘀血而致肺呼吸膜增厚，因为“肺为贮痰之器”，故阻滞“肺通天气”功能而呈“干咳或痰难咳出”之症[10]。

SIgA，IgG等抗体分子可与病原微生物特异结合，启动免疫防御效应，以阻止病原微生物黏附到易感细胞。从上气道至周围气道，SglA逐渐减少，而IgG趋于增高。多数抗菌、抗病毒抗体都属于IgG类抗体，故IgG是呼吸道黏液毯中重要的免疫防御成份之一。表2中显示，温燥组第六到十八天SIgA持续下降。表3显示，温燥组、常温燥组IgG第六、十二、十八天呈下降趋势，以第十二天显著。前期参与的课题组研究报道[11]，温燥组第七天至第十四天气道液中IgG始终为低水平（P＜0.01），该实验结果与前期研究相符。实验从一个侧面证实，外燥可能导致气道分泌液减少，同时因某种原因使与肺“卫气”有关的SIgA和IgG始终处于低水平，有理由认为气道SIgA、IgG抗体持续下降与温燥致病机制密切相关。与丁建中[11]教授研究的同期气道SIgA与IgG持续下降而削弱气道的“免疫屏障”功能导致“肺卫失合”相符。表明气道分泌液减少，气道局部免疫屏障减弱是外燥致病的重要基本病机之一。气道的局部免疫屏障功能受损,与外燥病因病机密切相关。此结果为研究外燥伤肺分子病机的特征性指标提供重要实验依据。

[参考文献]

[1]王明明，殷涛，张六通，等.外燥发生学探讨[J].中医杂志，2011,52(7): 550-551,561.

[2]袁卫玲，马淑珍，郭霞珍.肺脏功能季节性变化的特点探讨[J].中医杂志，2010,51(5):395-396.

[3]倪圣,丁建中.呼吸膜与呼吸系统疾病研究进展[J].长江大学学报：自科版,2013(11):150-153.

[4]倪圣,丁建中.气道黏液高分泌机制研究进展[J].长江大学学报：自科版,2013(3):97-101.

[5]张六通，丁建中，肖长义，等.外燥伤肺的生物学指标研究[J].中医杂志,20011,52(18):1584-1586.

[6]丁建中，张六通，龚权，等.温燥致病机制的实验研究[J].中医杂志，2007,48(11):1024-1026,1032.

[7]王江梅.燥湿之转化及治疗求真[J].中国中医基础医学杂志，2012,18 (6):603-605.

[8]成令忠，钟翠平，蔡文琴.现代组织学[M].上海:上海科学技术文献出版社，2003:905-906.

[9]汤毅.伤津证与生津法初探[J].中医杂志，2005，46(8):628-629.

[10]丁建中,张六通,向光盛,等.温燥对小鼠气道生物屏障的影响[J].中华中医药杂志(原中国医药学报),2012,27(8): 2067-2069.

[11]丁建中,龚权,张六通,等.温燥致病机制的实验研究[J].中医杂志，2007,48(11):1026-1026,1032.

Study on Effects of External Dryness to the Airway Immune and Secretory Function of Mice

HU Li-qun1, DING Jian-zhong2, LIU Guo-ping2
1. Xinzhou District Center for Disease Control and Prevention, Wuhan, Hubei Province, 430040 China; 2.The Yangtze University, Jingzhou, Hubei Province, 434025 China

[Abstract]Objective To observe the effect of external dryness on the local immune and secretion function of the respiratory tract in Kunming mice, and to study the pathogenesis of the disease. Methods This experiment was completed from October 2009 to May 2010. 120 SPF mice were randomly divided into warm dry group, normal temperature and dry group, normal temperature and humidity group and cool dry group, four groups, 30 in each group. After treatment of 6, 12, 18 days, the index for mucopolysaccharides, SIgA and IgG of the Airway lavage fluid in each group were detected. Results The content of Mucopolysaccharides decreased in warm dry set of the 12th and 18th day, cool and dry group was lowest on 12th day (P<0.05). The SIgA content continued to decrease in warm dry set from the 6th to 18th day. IgG content continued to decline in warm dry and normal temperature and dry set from the 6th to 18th day, and the warm dry set decreased more significantly. Conclusion External dryness may lead to immune barrier function of lung health imbalance, lung fluid formation decreased, the immune barrier function to“cilia and mucus blanket”of respiratory tract weakened, which provides the experimental basis for the study of lung with dry injury.

[Key words]External dryness; Airway; Immune function; Secretion function

[中图分类号]R254

[文献标识码]A

[文章编号]1674-0742（2015）07（c）－0019-03

[作者简介]胡利群（1974-），女，湖北武汉人，硕士，主管技师。

[通讯作者]刘国平（1974-），男，湖北武汉人，博士副教授。

收稿日期：（2015-04-23）