Ccbe1病毒对喉癌Hep- 2细胞VEGF- C表达的影响

李文媛,刘艳翠,尹国华,冯克俭,王莹牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江牡丹江　157011

Ccbe1病毒对喉癌Hep- 2细胞VEGF- C表达的影响

李文媛,刘艳翠,尹国华,冯克俭,王莹
牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江牡丹江157011

[摘要]目的探讨胶质和钙结合EGF区域1（Collagen and calcium binding EGF domains 1,Ccbe1）病毒对人喉癌细胞系Hep-2细胞增殖及血管内皮生长因子-C(vessel endothelium growth factor C,VEGF-C)表达的影响。方法用1×102，1×104，1×106pfu/mL 的Ccbe1腺病毒作用喉癌Hep-2细胞，细胞分为对照组（PBS），Ccbe1病毒高、中、低剂量组。观察各组细胞增殖情况，采用PCR检测各组细胞VEGF-C mRNA的表达水平。结果与对照组比较，Ccbe1病毒各剂量组细胞增殖显著增高，VEGF-C mRNA表达水平显著上升，且均有显著剂量依赖性，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论Ccbe1病毒可能通过上调淋巴管生成因子VEGF-C表达促进喉癌细胞增殖和淋巴管生成。

[关键词]Ccbe1病毒；VEGF-C；喉癌；Hep-2细胞

喉癌是我国东北地区最为常见的耳鼻咽喉科恶性肿瘤。发病率高，危害大。近年来，随着分子生物学和细胞学的发展，一系列关于喉癌发病与治疗的相关机制得到探讨[1]。目前发现多种淋巴管生成因子参与喉癌的生长与淋巴管转移，有研究表明Ccbe1（胶原和钙结合蛋白表皮生长因子-域-1）作为新发现的一种淋巴管生成因子，在斑马鱼胚胎期进行Ccbe1基因沉默后，其淋巴管和血管完全丧失[1]。但关于Ccbe1对肿瘤细胞的影响尚不清楚。该实验在2014年3月—2014年6月期间通过观察Ccbe1病毒对喉癌Hep-2细胞增殖及VEGF-C的表达的影响，探讨Ccbe1对肿瘤细胞淋巴管生成的作用机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂

实验时间：2014年3月—2014年6月。胎牛血清（美国Hyclon公司），CCK-8法（美国Sigma公司），PCR试剂盒（Invitrogen公司）；引物设计（大连宝生物公司）。

1.2细胞株培养和病毒干预分组

人喉癌细胞株Hep-2（中国科学院上海细胞生物研究所），依据参考文献[3]进行培养，RPMI1640培养液（含10%胎牛血清），至对数期进行实验，制成单细胞悬液（4×105/mL）。Ccbe1病毒（Ccbe1 Adenovirus Mouse，购于美国abm公司，No.80829A)，实验分为空白对照组（PBS），Ccbe1低剂量组（1×102pfu/mL），Ccbe1中剂量组（1×104pfu/mL），Ccbe1高剂量组（1×106pfu/mL）。

1.3 CCK-8法检测

取各组单细胞悬液种植于96孔培养板（每孔100 μL），培养48 h后加入10 μL的CCK-8溶液（sigma公司），常规CCK-8法检测，酶联免疫检测仪上检测每孔的吸光度值(OD490)。

1.4实时荧光定量PCR检测

总RNA提取，采用Pollmann等[4]报道方法进行PCR反转录、检测及荧光定量分析。VEGF-C以及β-actin的引物的序列为: VEGF-C，上游5′-CTACAGATGTGGGGGTTGCT -3′，下游5′-CATCCAGCTCCTTGTTTGGT -3′；NF-κB，上游5′-GAAGAAGCGAGACCTGGA-3′，下游5′-TCCGGAACACAATGGCCA -3′；βactin，上游5′-TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC-3′，下游5′-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3′，分析方法利用2-△△CT方法。

1.5统计方法

所得数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料连续型变量采用（）表示，多组间均数比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Ccbe1对Hep-2细胞增殖的影响

培养1 d后，与对照组相比，Ccbe1各干预组能够显著促进Hep-2细胞生长，中剂量组和高剂量增殖高于低剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05)，培养3 d和5 d后，Ccbe1各干预组增殖增高，差异有统计学意义(P＜0.01)，其中Ccbe1高剂量组较中剂量组和低剂量组增殖更为显著，差异有统计学意义(P＜0.05)。其促进作用呈浓度依赖性（见表1）。

表1　CCK-8法检测Ccbe1对Hep-2细胞增殖增殖影响[n=6,（±s）]

表1　CCK-8法检测Ccbe1对Hep-2细胞增殖增殖影响[n=6,（±s）]

注：*与对照组比较，P＜0.01，#与低剂量组比较，P＜0.05，△与中剂量组比较，P＜0.05。

对照组低剂量组中剂量组高剂量组组别0.025±0.09 （0.046±0.011）*（0.075±0.012）*#（0.082±0.015）*#1 d 0.112±0.015 （0.235±0.024）*（0.299±0.019）*#（0.367±0.023）*#△0.321±0.025 （0.535±0.034）*（0.639±0.036）*#（0.727±0.023）*#△3 d　5 d

2.2各组细胞VEGF-C mRNA相对表达水平比较

与对照组比较，Ccbe1病毒低、中、高剂量组VEGF-C mRNA相对表达水平显著增高，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中Ccbe1病毒高剂量组VEGF-C mRNA相对表达水平显著高于Ccbe1病毒低、中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05)，见表2。

3　讨论

喉癌是耳鼻咽喉科最常见的恶性肿瘤，在我国东北地区发病率逐年上升，其中近95%患者为鳞状上皮癌，其细胞系为hep-2细胞，尽管近年来相关治疗如激光切除术和化学药物治疗已取得了较大进展，但淋巴管转移和复发率仍高达20%，因此，开发新的有效治疗喉癌淋巴管转移的方法已尤为迫切。

表2　各组细胞VEGF-C mRNA相对表达水平比较[n=6,（±s）]

表2　各组细胞VEGF-C mRNA相对表达水平比较[n=6,（±s）]

注：*与对照组比较，P＜0.01，#与低剂量组比较，P＜0.05，△与中剂量组比较，P＜0.05。

对照组低剂量组中剂量组高剂量组组别0.0015±0.0006 （0.0026±0.0004）*（0.0038±0.0005）*#（0.0052±0.0006）*#△VEGF-C mRNA

以往研究已经证实喉癌中VEGF-C表达上调，但对于VEGF-C在喉癌细胞系方面的研究仍存在争议[3]。VEGF-C能够选择性增强淋巴管内皮细胞有丝分裂；刺激内皮细胞增生并促进淋巴管生成；参与淋巴管外基质重塑。到目前为止已有大量的研究证明在胚胎发育、组织再生和肿瘤的生长过程VEGF-C在淋巴管新生过程中有极其重要的作用[1]。最近发现的分泌蛋白Ccbe1是淋巴管生成不可或缺的重要生成因子。研究发现[2]在斑马鱼、小鼠和人类，Ccbe1基因突变导致淋巴管增生和淋巴水肿（Hennekam综合征），Ccbe1促进淋巴管新生并且可能参与肿瘤细胞的增殖。此外，发现胚胎期在一些组织Ccbe1和其他的淋巴管生成因子表达下降，并证实Ccbe1能够独立调节淋巴管生成。但Le等[5]发现Ccbe1在卵巢癌细胞株中显著下调，与卵巢癌的发生和发展呈负相关。前期研究[6-7]证实喉癌中Ccbe1表达显著增高，参与喉癌淋巴管生成和血管生成，该研究从体外实验探讨Ccbe1的作用机制。

Jeltsch[2]表明Ccbe1是VEGF-C活化的必要条件，VEGF-C信号通路可能是Ccbe1作用的重要下游信号通路。该研究CCK-8法结果表明，Ccbe1各干预组能够显著促进Hep-2细胞生长，其中3 d和5 d，Ccbe1高剂量组较中剂量组和低剂量组增殖更为显著，显示Ccbe1干预组能够显著促进喉癌hep-2细胞增殖，并具有浓度依赖性，证实了Ccbe1能够促进Hep-2细胞增殖能力，这与Pollmann等的研究结果相一致[4，8]。但Ccbe1的作用机制目前尚不明确，该研究发现与对照组比较，Ccbe1病毒各剂量组VEGF-C mRNA表达水平均显著上升，其中Ccbe1病毒高剂量组VEGF-C mRNA相对表达水平显著高于Ccbe1病毒低、中剂量组，高于对照组4～5倍，VEGF-C是重要的淋巴管生成因子，因此我们推测Cebe1可能通过上调VEGF-C信号通路发挥作用。

综上所述，该研究证实了Ccbe1能够上调喉癌hep-2细胞中VEGF-C表达，提示Ccbe1可能通过活化VEGF-C，促进喉癌细胞增殖和淋巴管转移。

[参考文献]

[1]Du L, Li H, Zhu C, et al.Incidence and mortality of laryngeal cancer in China, 2011[J]. Chin J Cancer Res, 2015(1):52-58.

[2]Jeltsch M, Jha SK, Tvorogov D,et al. CCBE1 enhances lymphangiogenesis via A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs-3-mediated vascular endothelial growth factor-C activation[J].Circulation, 2014,129(19):1962-1971.

[3]Xu Y, Yuan L, Mak J,et al. Neuropilin-2 mediates VEGF-C-induced lymphatic sprouting together with VEGFR3[J]. J Cell Biol，2010，188(1): 115-130.

[4]Pollmann C, Hogerling R, Kiefer F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function[J].Adv Anat Embryol Cell Biol, 2014,214(3):167-86.

[5]Barton CA,Gloss BS,Qu W,et al.Collagen and calcium-binding EGF domains 1 are frequently inactivated in ovarian cancer by aberrant promoter hypermethylation and modulates cell migration and survival[J].Br J Cancer,2010,102(1):87-96.

[6]李文媛,王莹,刘艳翠,等.胶原和钙结合EGF域1的表达与直肠癌组织淋巴管生成及预后的关系[J].中国老年学杂志，2014，34(14): 3849-3851.

[7]李文媛,王莹,孙平,等.喉癌组织中Ccbe1、VEGF-D的表达变化及意义[J].山东医药, 2013,53（23）:21-24.

[8]Zou Z, Enis DR, Bui H, et al.The secreted lymphangiogenic factor CCBE1 is essential for fetal liver erythropoiesis[J].Blood, 2013 ,121(16): 3228-36.

Impact on VEGF-C Expression of Ccbe1 Virus to Laryngeal Cancer Hep-2 Cells

LI Wen-yuan,LIU Cui-yan,YIN Guo-hua,FENG Ke-jian,WANG Ying
Department of Anatomy, Mudanjiang Medical University, Mudanjiang, Heilongjiang Province, 157011 China

[Abstract]Objective To investigate the impact on Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) expression of Collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1 (Ccbe1) virus to laryngeal cancer Hep-2 Cells. Methods Cells were divided into control group (PBS), Ccbe1 virus in high, medium and low dose group, by the way of Ccbe1 adenovirus (in respective units 1× 102, 1×104, 1×106pfu/mL) acting on laryngeal cancer Hep-2 Cells. The cell proliferation was observed and the expression level of VEGF-C mRNA was detected by PCR for each group. Results Compared with the control group, the cell proliferation of Ccbe1 virus was significantly higher in each group, and the VEGF-C mRNA expression level was significantly increased than that in control group (P<0.05), and there were significant dose-dependence. Conclusion Ccbe1 virus may upgrade Lymph vessel generation factor VEGF-C expression to promote hep-2 cells proliferation and lymphatic formation in laryngeal cancer.

[Key words]Collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1 (Ccbe1) virus; Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C); Laryngeal cancer; Hep-2 cell

[中图分类号]R739.65

[文献标识码]A

[文章编号]1674-0742（2015）07（c）－0010-03

[基金项目]黑龙江省教育厅科研项目（12531745）

[作者简介]李文媛（1980-），女，黑龙江伊春人，硕士，讲师，主要从事肿瘤淋巴管生成机制研究。

[通讯作者]王莹( 1977-)，男，黑龙江哈尔滨人，博士，副教授，研究方向:肿瘤发生机制。

收稿日期：（2015-04-25）