阿托伐他汀对自发性高血压大鼠左室肥厚的影响及其可能机制

蒲丽君，赵珂，罗勇川北医学院附属医院心内科，四川南充637000

阿托伐他汀对自发性高血压大鼠左室肥厚的影响及其可能机制

蒲丽君，赵珂，罗勇
川北医学院附属医院心内科，四川南充637000

[摘要]目的应用阿托伐他汀抑制自发性高血压大鼠出现左室肥厚心肌过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和p21表达及其改善机制。方法随机将同批次16只具有8周龄的自发性高血压大鼠分为阿托伐他汀ATV组与自发性高血压SHR组（各8只）；另选取8只同周龄大鼠作为正常血压WKY组。采用阿托伐他汀对ATV组进行灌胃，50 mg/（kg·d）；对SHR组与WKY组进行等容量蒸馏水灌胃，测量3组大鼠血压，5周/次；持续干预10周后，对其血压及血脂水平进行观察与测量，同时计算其心肌肥厚指标，并使用RT-PCR、免疫组化观察PPARγ和p21的表达。结果血脂及血压观测结果显示，SHR组与ATV组无显著差异，ATV组心肌肥厚指标明显低于SHR组，差异有统计学意义（P<0.01）；ATV组PPARγ和p21的表达明显高于SHR组，差异有统计学意义(P<0.01)。心肌组织PPARγ和p21 mRNA的表达表现出负相关性。结论阿托伐他汀可自行对自发性高血压大鼠心肌细胞中PPARγ、p21上调以对细胞周期进行调节，对高血压左室肥厚具有改善作用。

[关键词]激活受体γ；p21；自发性高血压大鼠；左室肥厚；阿托伐他汀

心血管疾病常见病之一高血压，其心脏彩超显示心脏由于长期受压超负荷下为左心室肥厚，同时左室肥厚也是心脏终末心衰发展过程的共同基础，同时也是引发高血压患者出现严重心血管疾病的重要危险因素。参与这一病理生理过程的因素较为多样且复杂，常规除去高血压的影响外，细胞的增殖与凋亡失衡也与其关系密切。多种蛋白及基因对细胞的增殖与凋亡进行调控。其中过氧化物酶体增值物激活受体γ（PPARγ）是细胞分化过程中的重要转录因子，主要参与脂质及糖代谢，并在细胞增殖凋亡过程中发挥重要调控作用，其在高血压发展与左室肥厚的关系探究中具有重要观察意义。p21可促导细胞的增殖与分化，其实增殖细胞周期的负性调节因子。他汀类药物除具有调节血脂的作用外还能够发挥心血管保护效应，大量研究表明阿托伐他汀可抑制胶原蛋白的合成，有抗氧化、抗炎的作用，使其可以对高血压左室肥厚进行干预和影响。但有关基因PPARγ、p21是否参与其中目前研究较少。该研究于2014年8月12日—2014 年10月14日以SHR为实验模型，探讨阿托伐他汀、高血压左室肥厚以及PPARγ、p21之间的联系和影响。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组

实验开始于2014年8月12日，历时10周到2014年10月14日结束。24只大鼠均于重庆藤清生物技术有限公司购入，其中16只同批次的SHR、ATV以及8只WKY大鼠，均为体重在120～150 g的8周龄雄性大鼠，清洁级。将16只8周龄自发性高血压大鼠随机分为两组各8只，分别为阿托伐他汀组(ATV组)与自发性高血压对照组（SHR组）；另选取8只同周龄大鼠作为正常血压WKY组。对ATV组进行阿托伐他汀(辉瑞制药有限公司)灌胃，50 mg/（kg·d）；对SHR组与WKY组进行等容量蒸馏水灌胃，测量3组大鼠血压，5周/次；持续干预10周后，每隔5周测1次血压。10周后,观察大鼠血压、血脂水平，计算心肌肥厚指标，采用免疫组化及RT-PCR观察PPARγ和p21的表达。

1.2血压测定

采用尾袖法无创式测大鼠血压，从第八周龄开始，每5周测血压1次。

1.3左室质量指数

10周后大鼠空腹称取体重（BW），使用2.5%戊巴比妥钠进行注射麻醉，剂量50 mg/kg，腹主动脉抽取2 ml血液进行检测，分别检测TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。将大鼠心脏取出吸干并称其重量（HW），并分离出左心室（包括室间隔），冲洗及吸干后称取左心重(LVW)；计算心脏重量与体重的比值（HW/BW）以及左心室重点与体重的比值（LVW/BW），并以此作为判断心肌肥厚的指标。自心尖部取心肌组织约4 mm放入10%甲醛内固定，用于制备组织蜡块。剩余左心室组织保存于-80℃冰箱内用于提取RNA。

1.4血脂测定

将采集的腹主动脉血离心分离得到血清，采用Hitachi全自动化学分析仪测定血清中TC、TG、LDL-C及HDL-C的水平。

1.5心肌组织形态学检测

将石蜡包埋的心肌组织用石蜡冰冻切片机（LEICA SM 2500E）切片，厚度为4μm，HE染色，电子显微镜下观察心肌细胞形态。

1.6心肌细胞p21、PPARγ的分布

严格按照SABC试剂盒说明书进行操作。使用由美国Santa Cruz公司生产的鼠抗鼠p21单克隆抗体以及鼠抗鼠PPARγ单克隆抗体作为一抗；由中国武汉博士德生物工程公司生产的羊抗鼠IgG作为二抗。光学显微镜下显示，心肌细胞正常状态下呈蓝色细胞核，p21、PPARγ的表达呈棕色（+）。每只大鼠均随机抽取5张切片在×400的高倍镜下观察阳性心肌细胞所占比例，计算其蛋白的表达率。

1.7心肌组织p21、PPARγ mRNA表达水平

取100 mg心肌细胞标本，采用TRIzol法对标本进行总RNA提取，并使用UV-2500紫外线分光光度计算RNA纯度，取2 μg总RNA根据逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应,制备cDNA ,作为PCR反应的模板。使用中国上海生工生物工程公司合成的引物具体见表1。在94℃温度下预变5 min，后进入30个循环。预变过程：预变30 s后温度降至56℃退火，30 s，温度升至72℃延伸30 s，最后温度定为74℃延伸5 min。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳PCR终产物8 μL，时间约40 min，采取凝胶成像仪对条带的灰度值进行分析，计算基因、GAPDH的灰度比作为mRNA的表达相对量。

表1　目的基因及内参照GAPDH基因的引物序列

表3　ATV对大鼠血脂及心肌肥厚指标的影响（±s）

表3　ATV对大鼠血脂及心肌肥厚指标的影响（±s）

注：与WKY组比较，aP<0.05；与SHR组比较，bP<0.05。

WKY（n=8）SHR（n=8）ATV（n=8）组别0.53±0.09 (0.31±0.07)a(0.35±0.11)aTG (mmol/L) 2.44±0.32 (1.36±0.18)a(1.37±0.11)aTC (mmol/L) 0.91±0.20 (0.41±0.11)a(0.39±0.06)aLDL-C (mmol/L) 1.29±0.14 (0.83±0.07)a(0.82±0.07)aHDL-C (mmol/L) 3.36±0.21 (4.48±0.47)a(3.90±0.40)ab2.82±0.18 (3.77±0.47)a(3.26±0.29)abHW/BW (mg/g) LVW/BW (mg/g)

1.8统计方法

采用统计软件包SPSS 17.0对所有数据进行分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间变量的比较采用单因素方差法分析，以P<0.05认为差异有统计学意义。采用Spearman相关分析PPARγ和p21 mRNA的表达与心肌肥厚指标的相关性。

2　结果

2.1阿托伐他汀药物对血压、血脂水平的影响

ATV组和SHR组的血压均显著高于WKY组，差异有统计学意义（P<0.01），而ATV组和SHR组两组间的血压，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。10周后，ATV、SHR两组血脂水平均明显低于WKY组，差异有统计学意义（P<0.05），在阿托伐他汀干预后ATV组血脂水平与SHR组相比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

表2　各组大鼠血压值[mmHg，（±s）]

表2　各组大鼠血压值[mmHg，（±s）]

注：与WKY组比较，aP<0.01。

WKY（n=8）SHR（n=8）ATV（n=8）组别收缩压舒张压收缩压舒张压收缩压舒张压血压141.0±16.0 100.5±11.2 （162.0±32.6）a（122.4±15.9）a（160.8±31.9）a（121.0±24.6）a8 weeks 141.7±19.2 99.4±10.3 （178.1±24.7）a（131.4±22.1）a（175.2±30.3）a（127.9±31.2）a142.0±15.9 96.9±10.5 （182.6±26.2）a（135.8±21.2）a（176.5±27.6）a（134.6±20.8）a13 weeks　18 weeks

2.2阿托伐他汀药品对心肌肥厚指数的影响

对比发现，SHR组大鼠HW/BW、LVW/BW明显高于WKY组大鼠；ATV组上述指标均降低且与SHR组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但并未降至正常水平，与WKY组比较，差异有统计学意义（P<0.05），具体结果见表3。

2.3心肌组织的光镜下观察

WKY组：形态正常，排列整齐，无明显肥大；SHR组：形态异常、排列紊乱，明显肥大，部分心肌纤维出现断裂；ATV组：介于WKY、SHR两组之间，形态及排列较SHR组相比较为整齐规则，心肌纤维断裂较少，细胞肥大较少。见图1。

图1　心肌组织病理形态学改变（HE染色，×400）A:WKY组；B:SHR组；C:ATV组。

2.4免疫组化检测结果

结果显示：p21、PPARγ蛋白均在大鼠心肌细胞核内表达，SHR组和ATV组PPARγ和p21蛋白的（+）表达率均低于WKY组，差异有统计学意义（P<0.05）；ATV干预后，PPARγ和p21的（+）表达率明显上升，ATV组高于SHR组，差异有统计学意义（P<0.05），见图2、图3。

图2　免疫组化观察心肌细胞PPARγ蛋白表达（×400）A:WKY组；B:SHR组；C: ATV组。表达（+）的心肌细胞核呈棕黄色（如白色箭头所示），表达（-）的心肌细胞核呈蓝色（如黑色箭头所示）

图3　免疫组化观察心肌细胞p21蛋白表达影响（×400）A:WKY组；B:SHR组；C:ATV组

2.5RT-PCR结果

结果显示：SHR、ATV两组大鼠p21、PPARγ mRNA相对表达量均低于WKT组大鼠，差异有统计学意义（P<0.05）；ATV干预后，p21、PPARγ mRNA的表达均上升，ATV组高于SHR组，差异有统计学意义（P<0.05），见图4、表4。

A组　B组C组Marker A组　B组C组Marker图4 PPARγ、p21的电泳图A:WKY组；B:SHR组；C:ATV

表4　阿托伐他汀对PPARγ、p21mRNA表达的影响（±s）

表4　阿托伐他汀对PPARγ、p21mRNA表达的影响（±s）

注：与WKY组相比较aP<0.05；与SHR组相比较*P<0.05。

PPARγ P21基因1.26±0.03 1.12±0.05 WKY组（1.02±0.03）a（0.81±0.08）a（1.12±0.04）ab（0.98±0.07）abSHR组　ATV组

2.6p21、PPARγ mRNA与心肌肥厚相关性

p21 mRNA的表达与HW/BW、LVW/BW均呈高度负相关，差异有统计学意义（r=-0.708、-0.667，P<0.0001）；PPARγ mRNA的表达与HW/BW、LVW/BW同样均呈高度负相关，差异有统计学意义（r=-0.859、-0.902，P<0.0001）。

3　讨论

高血压可使心肌肥厚、心室重构，是对心脏损伤的表现之一，也是引起心血管事件的独立危险因素[1]。研究表明，他汀类药物除降脂外还可干预细胞周期，以此对多种肿瘤细胞和血管平滑肌细胞进行增殖与凋亡调节，但现如今对心肌细胞增殖与凋亡是否也通过干预细胞周期改善心室重构目前尚不清楚。

近年有研究表明，在心肌肥厚的发病机制中，p21参与其中并起到重要作用。在国外学者的研究中表明，左心室肥厚可使p21蛋白表达能力下降，引起心肌细胞肥大[4]。且还有学者对阿托伐他汀的研究中发现，他汀类药物可通过下调细胞周期蛋白相关的抑制蛋白促进细胞周期蛋白的表，使细胞衰老过程减慢。也有研究表明，他汀类药物主要通过对p21、p27的调节实现对肿瘤细胞周期调节的过程[5]。该实验结果表明，p21表达降低可介导心肌细胞的肥大、促进心肌细胞增殖，从而参与心肌肥厚的发生。

有研究表明[6]PPARγ的活化可能与心肌细胞肥大的负性调节有关,可抑制心肌细胞增殖，进而改善心室重构。在过去的研究中人们发现，阿托伐他汀对大鼠心肌中PPARα、PPARβ、PPARγ的表达有促进作用，明显减少了左心室壁的厚度，逆转心室重构[7]。也有学者对压力负荷诱导心肌肥厚的大鼠进行研究，结果发现，阿托伐他汀可使左心室壁厚度减小，上调PPARγ蛋白的表达。因此, PPARγ的激活应用阿托伐他汀改善心肌肥大的作用有极大关系。在该实验中，PPARγ表达上调可改善心肌肥厚症状，也证实了PPARγ表达可对心肌肥厚起到负调控作用，与既往研究基本相符[8]。

在心血管方面，Li M等[ 9]在体外的研究结果表明，PPARγ活化可通过诱导血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1)的表达及上调p21的表达来抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖。Zhang D等[ 10]在体内实验中也同样表明，肺动脉高压大鼠PPARγ的激活可明显降低右心室的收缩压，抑制右心室肥厚，部分抑制肺血管的重构，其机制可能与上调HO-1 and p21的表达有关。通过该研究可推测，阿托伐他汀可激活心肌PPARγ进行表达，间接影响p21表达上调，在两者共同作用下抑制了心肌肥大、心室重构等症状，而具体作用机制有待进一步深入研究。

该研究中还发现，阿托伐他汀并不影响血脂水平，结果提示其对心脏的改善作用与血压无关，但本文研究样本较小，可能影响此结果。

综上，阿托伐他汀可自行对自发性高血压大鼠心肌细胞中PPARγ、p21上调以对细胞周期进行调节，对高血压左室肥厚具有改善作用。

[参考文献]

[1]Yang W，Qi Q，Zhang H，et al. p21 (Waf1/Cip1) Polymorphisms and Risk of Esophageal Cancer[J]. Ann Surg Oncol，2010,17(5)：1453-1458.

[2]Chen J.Contribution of p16IN4Ka and p21WAF1 pathways to induction of premature senescence of human endothelial cells:permissive role of p53[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,290(4):H1575-1586.

[3]Chai J,Charboneau AL,Betz BL,et al.Loss of the hSNF5 gene concomitantly inactivates p21CIP/WAF1 and p16IN4Ka activity associated with replicative senescence in A204 rhabdoid tumor cells[J].Cancer Res, 2005,65(22):10192-10198.

[4]Kramer DL,Chang BD,Chen Y,et al.Polyamine depletion in human melanoma cells leads to G1 arrest associated with induction of p21WAF1/CIP1/SDI1,change in the expression of p21WAF1-regulated genes,and a senescence-like phenotype[J].Cancer Res,2001，61(21): 7754-7762.

[5]Tanner FC,Boehm M,Akyurek LM,et al.Differential effects of the cyclindependent kinase inhibitors p27 (Kipl), p21(cip1), andp16(Ink4)on vascular smooth muscle cell Proliferation[J].Circulation，2000,101(17): 2022-2025.

[6]Assmus B,Urbich C,Aicher A,et al.HMG-CoA reductase inhibitors reduce senescence and increase proliferation of endothelial progenitor cells via regulation of cell cycle regulatory genes [J].Circ Res,2003，92 (9):1049-1055.

[7]Han L, Li M, Liu Y, et al. Atorvastatin may delay cardiac aging by upregulating peroxisome proliferator-activated receptors in rats [J].Pharmacology, 2012, 89(1-2): 74-82.

[8]Grip O, Janciauskiene S, Lindgren S.Atorvastatin activates PPAR-gamma and attenuates the inflammatory response in human monocytes [J]. Inflamm Res, 2002, 51 (2) : 58-62.

[9]Li M, Li Z, Sun X, et al.Heme oxygenase-1/p21WAF1 mediates peroxisome proliferator-activated receptor-gamma signaling inhibition of proliferation of rat pulmonary artery smooth muscle cells[J].FEBS J, 2010, 277(6):1543-1550.

[10]Zhang D, Wang G, Han D,et al. Activation of PPAR-γ ameliorates pulmonary arterial hypertension via inducing heme oxygenase-1 and p21(WAF1): an in vivo study in rats[J]. Life Sci. 2014 ,98(1):39-43.

Effects and its Underlying Mechanism of Atorvastatin on Spontaneously Hypertensive rats with Left Ventricular Hypertrophy

PU Li-jun, ZHAO Ke, LUO Yong
Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Chuanbei Medical College, Nanchong, Sichuan Province, 637000 China

[Abstract]Objective To investigate the effect of atorvastatin on peroxisome proliferator-activated receptor-γ(PPARγ) and p21 expression of hypertrophic myocardium in spontaneously hypertensive rats and discuss the underlying mechanisms which atorvastatin improves left ventricular hypertrophy. Methods 16 eight -week -old male spontaneously hypertensive rats were randomly divided into atorvastatin group (ATV group, n=8) and spontaneously hypertensive rats group (SHR group, n=8). Age–matched Wistar - kyoto rats were served as normal blood pressure control group (WKY group, n=8). In ATV group, atorvastatin was given at a dose of 50 mg/(kg·d) perday by gastric gavage, and in SHR and WKY group, the same volume of distilled water by gavage. Measure the blood pressure every five weeks. Ten weeks later, blood pressure and plasma lipid levels were measured. The ratio of the heart weight to body weight (HW/BW) and the left ventricular weight to body weight (LVW/BW) were calculated as myocardial hypertrophy index. The expressions of PPARγ and p21 were investigated by the method of immunohistochemistry analysis and RT-PCR. Results There was not much difference of plasma lipid levels and blood pressure between ATV and SHR group. Compared with SHR group, Myocardial hypertrophy index decreased significantly in ATV group (P<0.01). The myocardium PPARγ and p21 expression increased significantly (P<0.01). The association between expression of PPARγmRNA and p21mRNA in cardiomyocytes and myocardial hypertrophy index are negative correlation. Conclusion Atorvastatin increases myocardium PPARγ and P21 expression and improves left ventricular hypertrophy in spontaneously hypertensive rats.

[Key words]Peroxisome proliferator-activated receptor-γ; P21; Spontaneously hypertensive rats; Left ventricular hypertrophy; Atorvastatin

[中图分类号]R544.1

[文献标识码]A

[文章编号]1674-0742（2015）07（c）－0012-04

[基金项目]川北医学院苗圃基金（MP-ZK-24）

[作者简介]蒲丽君（1978.4-），女，四川南充人,硕士，主治医师，研究方向:高血压病心衰的发病机制。

[通讯作者]罗勇（1966.2-），男，四川南充人，硕士研究生，教授，主要从事心血管疾病临床与基础研究。

收稿日期：（2015-04-25）