乳没接骨丸质量标准研究*

毛和平，路宁维，谢六生，刘光斌，董钰明

1酒钢医院药学部，甘肃嘉峪关735100；2兰州大学药学院；

3淮阴工学院江苏省介入医疗器械研究重点实验室

乳没接骨丸质量标准研究*

毛和平1，路宁维2，3，谢六生1，刘光斌1，董钰明2△

1酒钢医院药学部，甘肃嘉峪关735100；2兰州大学药学院；

3淮阴工学院江苏省介入医疗器械研究重点实验室

目的：建立乳没接骨丸的质量标准。方法：采用显微鉴别法对制剂中没药、续断、红花和土鳖虫进行定性鉴别；采用薄层色谱法对红花和当归进行定性鉴别；采用高效液相色谱法测定制剂中补骨脂素和异补骨脂素含量。色谱柱为Iner tsi l C18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-水(52∶48，v/v)；流速为0.80mL/min；检测波长为246 nm。结果：显微鉴别结果清晰；薄层色谱斑点清晰，分离度良好，阴性无干扰，专属性强，重复性良好；补骨脂素和异补骨脂素分别在5.20～83.6μg/mL(r=0.999 1)和4.95～79.2μg/mL(r=0.9995)范围内有良好的线性关系；平均回收率分别为99.1%(RSD=1.55%，n=9)和99.5%(RSD=2.08%，n=9)。结论：本方法简便、可靠、准确，可用于乳没接骨丸的质量控制。

乳没接骨丸；质量标准；补骨脂素；异补骨脂素；显微鉴别；薄层色谱；高效液相色谱

乳没接骨丸是在酒钢医院使用多年的固定处方基础上，进一步应用现代医学科学方法，经多年基础实验研究和五年以上临床应用研究，根据现代制剂工艺制备的水泛丸。由乳香、没药、红花、当归、自然铜、补骨脂、川续断和土鳖虫8味药物组成，经粉碎、加工制成中药丸剂，具有活血化瘀、消肿生肌、续筋接骨之功效。临床上主要用于跌打损伤、筋断骨折、瘀滞肿痛的治疗。

乳香和没药活血止痛，消肿生肌为君药［1-4］；当归和红花活血化瘀，疏通经脉为臣药［5-7］；土鳖虫破血逐瘀，续筋接骨为佐药［8-9］；自然铜、补骨脂，川续断助土鳖虫续筋接骨为使药［10-13］，全方活血化瘀，消肿生肌，续筋接骨为主。

本实验采用显微鉴别方法对制剂中没药、红花、续断和土鳖虫进行鉴别；采用薄层色谱法(TLC)对红花和当归进行鉴别；采用高效液相色谱法(HPLC)测定补骨脂素和异补骨脂素的含量，为全面有效控制乳没接骨丸的质量提供科学依据。

1 仪器与材料

戴安Dinonex Ul timate 3000高效液相色谱仪，二极管阵列紫外检测器，手动进样器，Chromeleon色谱工作站(美国Dionex公司)；Inertsi l C18(150×4.6 mm，5μm)色谱柱；分析天平(上海奥豪斯Discovery专业性分析天平)；KH-300DB型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；Motic B5系列无限远校正光学系统显微镜(麦克迪奥实业集团有限公司)；ZF-3型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)。

自制乳没接骨丸(批号：20110201、20110202、20110203)；红花对照药材(中国药品生物制品检定所，批号：120907-201010)；当归对照药材(中国药品生物制品检定所，批号：120927-201014)；补骨脂素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110739-200814)；异补骨脂素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110738-201012)；甲醇(色谱纯，山东禹王试剂)；二次重蒸馏水(兰州大学GLP实验中心)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别［14］取乳没接骨丸，研细，挑取适量样品，置载玻片中央，滴加水合氯醛试液2滴，透化后制片。置显微镜下观察：不规则碎块淡黄色，半透明，渗出油滴，加热后油滴溶化，现正方形草酸钙结晶(没药)；草酸钙簇晶甚多，直径15～50μm，散在或存在于皱缩的薄壁细胞中，有时数个排列成紧密的条状(续断)；花粉粒类圆形、椭圆形或橄榄形，直径约至60μm，具3个萌发孔，外壁有齿状突起。草酸钙方晶存在于薄壁细胞中，直径2～6μm(红花)；体壁碎片黄色或棕红色，有圆形毛窝，直径8～24μm，可见长短不一的刚毛，有的具纵直纹理(土鳖虫)，见图1。

图1 乳没接骨丸显微鉴别图谱

2.2 TLC鉴别

2.2.1 红花TLC鉴别［14］取乳没接骨丸适量，碾碎，称取粉末2.0 g，加80%丙酮溶液6mL，密塞，振摇15分钟，静置，取上清液作为供试品溶液。另取红花对照药材粉末0.5 g，加80%丙酮溶液5mL。同法制成对照药材溶液。另按处方比例制备不含红花的阴性制剂，同法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一硅胶HF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)为展开剂，展开，取出，晾干，观察斑点。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照品在此处无干扰，见图2。

图2 乳没接骨丸中红花TLC色谱图

2.2.2 当归的TLC鉴别［14］取乳没接骨丸适量，碾碎，称取粉末6.0 g，加甲醇20mL，超声处理(120W，40 kHz)15分钟，滤过，滤液浓缩至1mL，作为供试品溶液。另取当归对照药材1.0 g，同法制成对照药材溶液。另按处方比例制备不含当归的阴性制剂，同法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验，吸取上述两种溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品在此处无干扰，见图3。

图3 乳没接骨丸中当归TLC色谱图

2.3 补骨脂素和异补骨脂素HPLC测定［14］

2.3.1 色谱条件Iner tsi l C18色谱柱(150mm× 4.6mm，5μm)，以甲醇-水(52∶48，v/v)为流动相，检测波长为246 nm，柱温25℃，流速0.80mL/min，进样量10μL。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取补骨脂素和异补骨脂素对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成每1mL中约各含10μg的溶液，即得对照品溶液。

2.3.3 供试品及阴性对照品溶液的制备 取乳没接骨丸适量，研细，取粉末约5.0 g(相当于补骨脂0.50 g)，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，密塞，超声处理40分钟(120W，40 kHz)，待冷却至室温后滤过，并用甲醇洗涤3次，10mL/次，滤液再经微孔滤膜(0.22μm)滤过，最后定容至100mL量瓶中，用流动相稀释1倍，即得供试品溶液。取按处方比例及工艺制备缺补骨脂样品，同供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。

2.3.4 专属性实验 分别取对照品溶液，供试品溶液及阴性对照品溶液，按“2.3.1”项色谱条件进样分析。结果表明，供试品溶液在该色谱条件下分离度良好，阴性无干扰，见图4。

图4 乳没接骨丸HPLC色谱图

2.3.5 线性关系考察 精密称取补骨脂素和异补骨脂素对照品各约20 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解并稀释至刻度，摇匀备用。精密量取该溶液适量，加流动相分别稀释25、50、100、200、400倍，分别得到5个浓度的对照品溶液。0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，按“2.3.1”项色谱条件测定峰面积。分别取上述溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积。以对照品浓度(C)为横坐标，峰面积平均值(A)为纵坐标，计算，得回归方程。补骨脂素和异补骨脂素的回归方程分别为A=3.742 93C+81.277 01 (r=0.999 1)和A=1.59 802 C+39.091 63(r=0.999 5)。结果表明，补骨脂素在浓度为5.20～83.6μg/mL范围内，异补骨脂素在浓度为4.95～79.2μg/mL范围内，其浓度与色谱峰峰面积线性关系良好。

2.3.6 精密度实验 精密吸取对照品溶液10μL，按上述条件重复测定6次，结果补骨脂素和异补骨脂素峰面积RSD分别为1.25%(n=6)和1.38% (n=6)，保留时间RSD分别为0.15%(n=6)和0.12% (n=6)，表明方法精密度良好。

2.3.7 稳定性实验 取同一供试品溶液分别于0，2，6，8，12小时测定补骨脂素和异补骨脂素的含量，测得峰面积RSD分别为1.59%(n=5)和 1.90%(n=5)，保留时间RSD分别为0.18%(n=5)和0.15%(n=5)。结果表明供试品溶液在12小时内基本稳定。

2.3.8 重复性实验 取同一批号(20110201)样品6份，按“2.3.3”项下供试品制备方法分别处理，按“2.3.1”项色谱条件测定样品中补骨脂素和异补骨脂素的含量，测得补骨脂素和异补骨脂素含量RSD分别为1.34%(n=6)和1.47%(n=6)，结果表明该方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率实验 取已测定的乳没接骨丸样品(批号：20110201)9份，每份约5.0 g，精密称定，分别精密加入一定量的补骨脂素和异补骨脂素对照品，按“2.3.3”项下制备样品，测定补骨脂素和异补骨脂素的含量，分别计算回收率，见表1—2。

2.3.10 含量测定 取3个不同批号(批号：20110201、20110202、20110203)样品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取10μL，依法测定补骨脂素和异补骨脂素的含量，结果3批样品中补骨脂素和异补骨脂素的含量(g/g)分别为0.046%和0.037%，0.047%和0.038%，0.048%和0.039%。

表1 乳没接骨丸中补骨脂素加样回收率实验(n=9)

表2 乳没接骨丸中异补骨脂素加样回收率实验(n=9)

3 讨论

3.1 TLC鉴别 在红花和当归TLC鉴别时，分别从温度(15℃、25℃和30℃)，湿度(15%、25%和35%)以及不同薄层板(青岛裕民源和手铺板)3个方面考察了方法耐用性，结果斑点清晰，分离度良好，分离无明显差异，表明方法耐用性良好。

3.2 HPLC含量测定 补骨脂具有促进骨骼再生与重建、抗癌活性和提高免疫系统功能等作用［15］。补骨脂素和异补骨脂素均是补骨脂的有效成分。补骨脂素可促进成骨细胞的增殖与分化成熟，并抑制破骨细胞活性，发挥促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用［11］。异补骨脂素能促进骨髓充质干细胞向成骨细胞方向分化［16］。《中国药典》2010年版一部收载了补骨脂原药材中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定方法，本研究对该方法进行了优化，建立了一种灵敏、专属可靠的高效液相色谱法测定制剂中的补骨脂素和异补骨脂素的含量。

3.3 含量限度 《中国药典》2010年版一部收载的补骨脂原药材质量标准规定“本品按干燥品计算，含补骨脂素(C11H6O3)和异补骨脂素(C11H6O3)的总量不得少于0.70%。”补骨脂在乳没接骨丸处方中占10%，忽略工艺因素，可计算在该制剂中补骨脂素和异补骨脂素的总量应为0.070%。考虑制备工艺中的损失量，按原药材的80%计算，补骨脂素和异补骨脂素在该制剂中的总含量不得低于0.056%。

因此，乳没接骨丸中补骨脂素和异补骨脂素的含量限度暂定为“本品每丸含补骨脂以补骨脂素(C11H6O3)和异补骨脂素(C11H6O3)的总量计，不得少于0.056%。”

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Research on theQuality Standard of RuMo JieGu Pills

MAO Heping1,LU Ningwei2,3,XIE Liusheng1,LIU Guangbin1,DONG Yuming2△
1 Pharmacy School of Jiugang Hospital,Jiayuguan 735100,China;
2 Pharmacy School of Lanzhou University;
3 Jiangsu Provincial Key Laboratory for InterventionalMedical Devices in Huaiyin Institute of Technology

Objective:To formulate the quality standard for RuMo JieGu pills.Methods:The qualities of Moyao(Commiphora myrrha Eng1.),Xuduan(Radix Dipsaci),Honghua(Carthamus tinctorius L.),and Tubiechong (Eupolyphaga seu Steleophaga)in the pillswere identified bymicroscopic examination;the naturesof Honghua and Danggui were detected by thin layer chromatography(TLC);the contentsof psoralen and isopsoralenweremeasured by high performance liquid chromatography(HPLC).The operating conditionsby HPLCwere InertsilC18 column (150mm×4.6mm,5μm),v(methanol)/v(water)=52/48 asmobile phase,0.80m L/m in as flow speed and wavelength 246 nm.Results:The resultsobserved bymicroscopy were obvious;the TLC spots developed were clearw ith efficientseparating ability,whichwere negative noninterferencew ith the characteristicsofhigh specificity and satisfactory reproducibility;the linear relation between psoralen among 5.20 and 83.6μg/m L(r=0.999 1)and the isopsoralen from 4.95 to 79.2μg/m L (r=0.999 5)was excellent;the average recoveries of psoralen and isopsoralen were 99.1%(RSD=1.55%，n=9)and 99.5%(RSD=2.08%，n=9),respectively.Conclusion:M icroscopy,TLC and HPLC arehandy,safeand accurate for RuMo JieGu pills to determine the quality.

RuMo JieGu pills;quality standard;psoralen;isopsoralen;microscopic identification;TLC;HPLC

R284.1

A

1004-6852(2015)01-0018-05

2014-01-06

江苏省介入医疗器械研究重点实验室开放基金资助项目(编号j r l209)。

毛和平(1965—)，男，副主任中药师。研究方向：中药制剂。

△通讯作者：董钰明(1971—)，男，博士学位，硕士研究生导师，副教授。研究方向：药物分析。