甘草渣总黄酮清除羟基自由基能力EPR检测*

张 娟，卿德刚，卢景芬，倪 慧△，孙 宇，贾晓光

1新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆乌鲁木齐830002；

2北京大学医学部天然药物及仿生药物国家重点实验室

甘草渣总黄酮清除羟基自由基能力EPR检测*

张 娟1，卿德刚1，卢景芬2，倪 慧1△，孙 宇1，贾晓光1

1新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆乌鲁木齐830002；

2北京大学医学部天然药物及仿生药物国家重点实验室

目的：探讨甘草渣总黄酮体外对羟自由基(·OH)的清除作用。方法：利用电子顺磁共振(EPR)技术检测不同浓度甘草渣总黄酮和甘草查耳酮甲对体外·OH的清除能力。结果：甘草渣总黄酮在0.25～25mg/mL范围内清除·OH能力随浓度增加呈上升趋势，且相同浓度时其清除·OH能力高于甘草查耳酮甲。结论：甘草渣总黄酮有明显清除自由基作用，该方法、结果可作为有效活性成分的初步筛选。

甘草渣；黄酮；电子顺磁共振；羟基自由基

羟基自由基是对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，可使组织中的糖类、氨基酸、蛋白质、核酸等物质发生氧化，遭受氧化性损伤和破坏，导致细胞坏死或基因突变等。许多药物的作用机理与药物清除自由基能力相关。甘草渣是胀果甘草(Glycyrrhiz inflate Bat.)生产甘草浸膏后的残留物，含丰富的黄酮，且主要为查耳酮类［1-6］，是宝贵的可再利用资源。已有研究证实甘草总黄酮对羟自由基具有清除作用［7-8］，但是关于甘草渣黄酮清除羟自由基作用少见报道。查耳酮含还原性较强的酚羟基，本研究利用电子顺磁共振(EPR)技术考察甘草渣总黄酮清除羟基自由基能力，为阐明其作用提供科学依据。

1 试剂与仪器

1.1 试剂 二甲基吡咯氮酮(DMPO)购自美国Sigma公司，使用前用活性炭纯化，使之无顺磁信号。水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯；甘草渣由新疆阿拉尔新农甘草产业有限责任公司提供，由本实验室提取，经UV检测总黄酮含量达到63%；甘草查耳酮甲为自制，经UV、IR、NMR和MS鉴定结构，含量大于95%。

1.2 仪器 ESP-300型电子顺磁共振仪(德国Bruker公司)；KQ3200型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Met t ler AE163电子天平、N-1100 EYEL4旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 试剂的配制称取NaCl 9.25g，KH2PO40.135g，Na2HPO4·12H2O1.425 g，将3者置100mL烧杯中，用蒸馏水溶解，以1mol/L的NaOH调pH至7.4，配制成0.05mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。

称取硫酸亚铁铵［FeSO4(NH4)2SO4·6H2O］适量，用PBS配制成1.0mmol/L的溶液。DMPO的浓度为0.9mmol/L，避光冷藏。H2O2用蒸馏水稀释至浓度6%。2.2 测定方法 甘草渣总黄酮和甘草查耳酮甲分别用PBS溶液配置成0、0.25、0.5、5、10、20 mg/mL的溶液，进行EPR测试。

2.3 羟基自由基产生体系0.05mol/L(pH=7.4)的PBS溶液，1.0 mmol/L FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O溶液，0.9mmol/LDMPO溶液，6%H2O2溶液。以上4种试剂各取5μL注入EP管，混匀后快速装入石英毛细管中，然后外加样品保护测试管，一并放入EPR波谱仪谐振腔中进行测定，作为对照样品。样品测定时分别用样品液代替PBS溶液。

2.4 EPR测试参数中心磁场(CF)：344.5mT；扫描宽度(SW)：10mT；扫描时间(ST)：60S；调制幅度(MA)：0.25mT；调制频率(MF)：100 KHz；微波频率(MF)：9.697GHz；微波功率(MP)：20mW；测试温度(T)：室温。

2.5 清除率计算I=(h0-hx)/h0×100%，h0表示空白体系中EPR谱信号强度测量平均值，hx为样品体系中EPR谱信号强度测量平均值，I值越大清除羟自由基能力越强，结果见图1。

图1 不同浓度甘草渣总黄酮和甘草查耳酮甲清除羟基自由基能力趋势图

3 讨论

本实验室建立了总黄酮提取方法，经UV检测总黄酮含量达63%。EPR研究表明，该甘草渣总黄酮在0.25～25mg/mL浓度范围内清除·OH自由基能力随浓度增加呈上升趋势，且在低浓度0.25mg/mL时对·OH自由基清除率已达50.53%，一般认为对自由基的清除率达到50%即有较好的清除作用。甘草渣总黄酮中甘草查耳酮甲含量最高［2］，故对其进行研究，结果显示相同浓度下甘草渣总黄酮清除羟基自由基能力优于甘草查耳酮甲，这可能是甘草渣中多种黄酮类物质协同作用的结果，其中是否存在其他具有清除自由基能力的物质或者增效物质，有待进一步考察。

EPR技术是利用具有未成对电子物质在磁场作用下吸收电磁波能量而完成电子能级间跃迁的特性，对顺磁性物质进行检测和分析的方法，具有灵敏度高、样品不受破坏和无干扰等优点，是目前检测自由基最直接、最有效的方法之一。本研究利用Fe2+经H2O2氧化成Fe3+，并产生短寿命的羟自由基，被自旋捕捉剂DMPO捕捉后，经电子顺磁共振仪检测，得到羟基自由基的特征谱图［9］。该方法快速灵敏，可用于体外对药物活性成分的初步筛选［9］。

［1］ 张娟，卿德刚，倪慧，等.甘草废渣中黄酮类化合物的分离及鉴定［J］.中国中医药科技，2009，16(2)：127-128.

［2］ 张娟，倪慧，卿德刚，等.HPLC法指认甘草废渣中黄酮类成分及含量测定［J］.中国中医药科技，2012，19(3)：233-234.

［3］张娟，刘芬，李宁，等.UPLC-TOP-MS法鉴定胀果甘草药渣中黄酮类成分［J］.现代药物与临床，2012.27(6)：558-561.

［4］ 李宁，刘芬，倪慧，等.新疆胀果甘草化学成分的分离与鉴定［J］.沈阳药科大学学报，2011，28(5)：368-370.

［5］ 陈超，李宁，倪慧，等.甘草化学成分分离、细胞培养和分析研究进展［J］.现代药物与临床，2011，26(3)：188-194.

［6］ 刘芬，李宁，倪慧，等.甘草药渣的研究进展［J］.中国现代中药，2011，13(2)：6-9.

［7］ 吴碧华，龙存国，王晓明，等.甘草总黄酮清除羟自由基作用的体外实验探讨［J］.川北医学院学报，2001，16(1)：3-5.

［8］Zhu SH，He Q，Gong YH，et al.Ef fects of Glycyr rhiza f lavonoid on f ree radical in duced brain lipid peroxident［J］.Pacta Univ Med Tongji，1994，23(2)：125-127.

［9］LU Jingfen，Mutel iefu Gulinuer，LI Tingfeng.Studies of antioxidation activity of natuial products with EPR methods［J］.Chinese Journal of Magnetic Resonance，2010，27(1)：22-31.

Scavenging Effectof Total Flavonoids from Glycyrrhiza Residues on HydroxylRadicalby EPRDeterm ination

ZHANG Juan1,QING Degang 1,LU Jingfen2,NIHui1△,SUN Yu1,JIA Xiaoguang1
1 Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and EthicalMateria Medica,Urumqi830002,China;
2 State Key Laboratory of Natural and Biomimetic drugs in Health Science Center of Peking University

Objective:To study the functions of total flavonoids in glycyrrhiza residues to scavenge hydroxyl radical(·OH).Methods:Scavenging effects of total flavonoids and licochalcone from glycyrrhiza residues in different concentrations on hydroxyl radical in vitro were detected by electron paramagnetic resonance(EPR). Results:As the concentrationsof total flavonoids from glycyrrhiza residues increased,scavenging effectswere raised when total flavonoids from glycyrrhiza residueswere between 0.25 and 25mg/mL,and the capacity of eliminating hydroxyl radical was higher than licochalcone when they were at the same concentration.Conclusion:Total flavonoids in glycyrrhiza residues could scavenge hydroxyl radicalobviously,and themethod could be taken as the firststep to screen active ingredients.

glycyrrhiza residues;flavonoids;electron paramagnetic resonance;hydroxyl radical

R284.1

A

1004-6852(2015)01-0011-02

2013-12-04

新疆维吾尔自治区卫生厅青年科技人才专项科研项目(编号2012Y06)。

张娟(1983—)，女，助理研究员。研究方向：天然药物的分析及制剂研究。

△通讯作者：倪慧(1964—)，女，硕士研究生导师，研究员。研究方向：天然药物的分析及制剂研究。