补骨脂有效成分在大鼠血清、肝、肾中的测定

张 昀，张 瑜

(河南大学药学院，河南开封 475001)

补骨脂是常用中药之一，具有温补脾肾、壮阳止泻之功效，目前已从中分离鉴定出三十余种化合物。现代药理研究表明，补骨脂具有抑制分离破骨细胞、抑制人胃癌细胞的生长、抗氧化、抗菌抗病毒、增强免疫力等作用［1-12］。补骨脂药材中主要活性成分为补骨脂素和异补骨脂素［13-15］，其定量测定已收载于《中国药典》2010年版［16］。因此，本实验旨在建立一种同时测定大鼠血清、肝脏、肾脏中补骨脂素和异补骨脂素的量的方法，为两者在体内的分布规律及药代动力学研究奠定基础。

1 仪器及试剂

AE200S电子分析天平 (上海梅特勒-托利多仪器有限公司);Agilent 1260型高效液相色谱仪;氯霉素 (中国药品生物制品检定所，产品批号130303-200614);补骨脂素对照品 (批号110739-201115，供含量测定用，中国食品药品检定院);异补骨脂素对照品 (批号110738-201012，供含量测定用，中国食品药品检定研究院);甲醇、乙腈为色谱纯 (均为天津四友精细化学品有限公司);水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent TC-C18(2)高效液相色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为水(A)-乙腈 (B)(65∶35)，梯度洗脱 (0～10 min，35%B→45%B;10～25 min，45%B→50%B)，体积流量1 mL/min，柱温30℃，检测波长295 nm(0～10 min，氯霉素)，246 nm(10～25 min，补骨脂素、异补骨脂素)，进样量20 μL。图谱见图1。

图1 对照品溶液和样品溶液的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.2 对照品贮备液的配制 精密称取补骨脂素、异补骨脂素对照品分别至10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，摇匀，储存于4℃冰箱待用。

2.3 内标标准溶液的配制 精密称取氯霉素对照品至25 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，摇匀，储存于4℃冰箱待用。

2.4 供试品溶液的制备

2.4.1 血清供试品溶液 精密吸取内标溶液20 μL置具塞离心管中，于缓和氮气流下吹干溶剂，加入血清样品 200 μL，乙酸乙酯-正己烷 (8 ∶1)800 μL，涡旋 2 min，低温离心 10 min(12000 r/min)，分取上层有机相置另一试管中，于缓和氮气流下吹干溶剂，残渣用100 μL甲醇溶解，即得。

2.4.2 肝脏供试品溶液 称取肝脏相同部位0.3 g，加生理盐水0.5 mL，10000 r/min匀浆，离心10 min(5000 r/min)，取上清液200 μL置于氮气吹干的含有20 μL内标标准液的具塞离心管中，加入乙酸乙酯-正己烷 (8∶1)800 μL，涡旋2 min，低温离心10 min(12000 r/min)，取上层有机相置另一试管中，缓和氮气流下吹干溶剂，残渣用100 μL甲醇溶解，即得。

2.4.3 肾脏供试品溶液的制备 称取肾脏相同部位0.5 g，加生理盐水0.5 mL，10000 r/min匀浆，离心10 min(5000 r/min)，取上清液200 μL置于氮气吹干的含有20 μL内标标准液的具塞离心管中，加入乙酸乙酯-正己烷 (8∶1)800 μL，涡旋2 min，低温离心10 min(12000 r/min)，取上层有机相置另一试管中，氮气流下吹干溶剂，残渣用100 μL甲醇溶解，即得。

2.5 线性关系考察 精密吸取内标溶液20 μL及一定体积的标准溶液于离心管中，于氮气流吹干溶剂，加入空白血清200 μL，配制补骨脂素、异补骨脂素质量浓度均为10、6、3、1、0.5、0.1 mg/L的系列血清样品溶液，按“2.4.1”项下操作，建立血清标准曲线。精密吸取内标溶液20 μL及一定体积的标准溶液于离心管中，于缓和氮气流吹干溶剂，加入空白肝匀浆200 μL，配制补骨脂素、异补骨脂素质量浓度均为10、6、3、1、0.5、0.1 mg/L的系列肝脏样品溶液，按“2.4.2”项下操作，建立肝脏标准曲线。精密吸取内标溶液20 μL及一定体积的标准溶液于离心管中，于氮气流吹干溶剂，加入空白肾匀浆200 μL，配制补骨脂素、异补骨脂素质量浓度均为10、6、3、1、0.5、0.1 mg/L的系列肾脏样品溶液，按“2.4.3”项下操作，建立肾脏标准曲线。分别以各样品中补骨脂素、异补骨脂素的质量浓度为横坐标，补骨脂素、异补骨脂素与内标峰面积之比为纵坐标，求得补骨脂素在血清、肝脏、肾脏中的线性回归方程分别为 Y=1.2467X+0.2028，r=0.9813;Y=1.6294X－0.0372，r=0.9901;Y=1.3354X+0.1379，r=0.9928。异补骨脂素在血清、肝脏、肾脏中的线性回归方程分别为Y=1.0984X+0.3472，r=0.9916;Y=1.5961X+0.0104，r=0.9924;Y=1.1278X－0.1495，r=0.9926。结果表明，补骨脂素、异补骨脂素在0.1～10.0 mg/L范围内线性关系良好。

2.6 日内日间精密度试验 大鼠空白血清中加入已知量的补骨脂素、异补骨脂素对照品，分别制成高、中、低质量浓度的样品，按“2.4.1”项下操作，结果补骨脂素日内精密度RSD(n=6)依次为3.62%、3.81%、10.54%，异补骨脂素为3.59%、3.67%、11.04%;补骨脂素日间精密度RSD(n=3)值依次为7.56%、7.07%、11.32%，异补骨脂素为7.34%、7.49%、9.67%。大鼠空白肝匀浆液中加入已知量的补骨脂素、异补骨脂素对照品，分别制成高、中、低质量浓度的样品，按“2.4.2”项下操作，结果补骨脂素日内精密度RSD(n=6)依次为3.96%、3.72%、10.63%，异补骨脂素为3.79%、4.02%、10.83%;补骨脂素日间精密度 RSD(n=3)依次为6.37%、6.89%、11.24%，异补骨脂素为6.74%、6.97%、10.86%。大鼠空白肾匀浆液中加入已知量的补骨脂素和异补骨脂素对照品，分别制成高、中、低质量浓度的样品，按“2.4.3”项下操作，结果补骨脂素日内精密度RSD(n=6)依次为4.53%、4.62%、11.65%，异补骨脂素为4.38%、4.69%、10.86%;补骨脂素日间精密度RSD(n=3)依次为7.24%、7.58%、12.31%，异补骨脂素为7.85%、8.04%、12.08%。

2.7 稳定性试验 取同一血清样品，分别于0、2、6、12、24 h进样，测得补骨脂素 RSD为4.59%，异补骨脂素RSD为4.96%，说明该样品在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 大鼠空白血清中加入已知量的补骨脂素、异补骨脂素对照品，分别制成高、中、低质量浓度的样品，按“2.4.1”项下操作，结果平均回收率(n=6)依次为补骨脂素97.84%(3.54%)，93.08%(4.36%)，90.69%(5.21%);异补骨脂素97.12% (3.76%)，93.22%(3.82%)，89.68%(5.47%)。大鼠空白肝匀浆液中加入已知量的补骨脂素、异补骨脂素对照品，分别制成高、中、低质量浓度的样品，按“2.4.2”项下操作，结果平均回收率 (n=6)值依次为补骨脂素 98.79% (2.97%)，97.60%(3.52%)，91.25% (4.03%);异补骨脂素97.97%(4.40%)，96.55%(5.86%)，90.71%(5.28%)。大鼠空白肾匀浆液中加入已知量的补骨脂素、异补骨脂素对照品，分别制成高、中、低质量浓度的样品，按“2.4.3”项下操作，结果平均回收率(n=6)值依次为补骨脂素96.80%(4.92%)，96.56%(5.09%)，92.30%(5.76%);异补骨脂素98.79%(4.94%)，96.22%(5.29%)，91.34%(5.67%)。结果表明，该方法切实可行。

2.9 样品测定 精密称取补骨脂药材粉末 (过四号筛)，按3.0 g/kg大鼠灌胃给药，1 h后眼眶取血，按“2.4”项下方法操作，制备血清、肝、肾供试品，内标法计算各供试品中补骨脂素、异补骨脂素的量。结果，血清中补骨脂素为6.96 mg/L、异补骨脂素为1.67 mg/L;肝脏中补骨脂素为4.98 mg/L、异补骨脂素为0.76 mg/L;肾脏中补骨脂素为2.04 mg/L、异补骨脂素为0.29 mg/L。

3 讨论

本实验建立了大鼠体内补骨脂中主要成分补骨脂素、异补骨脂素的同时检测方法。采用常用的紫外检测器，操作简单可行。对不同色谱柱进行了对比，补骨脂素与异补骨脂素均达到了基线分离，分离度良好。实验中对血清、肝、肾不同预处理方法做了初步考察，筛选了不同的萃取溶剂，丙酮、三氯甲烷等回收率低或有干扰，对不同配比的乙酸乙酯-正己烷进行考察，其中乙酸乙酯-正己烷(8∶1)提取效果最好，回收率高。故确定最佳萃取溶剂为乙酸乙酯-正己烷 (8∶1)。

通过预试验发现，空白血清、肝匀浆液、肾匀浆液在补骨脂素、异补骨脂素相同的保留时间内没有干扰。但是，如果大鼠有脂肪肝或高脂血症，则在补骨脂素和异补骨脂素相同的保留时间有干扰。因此，在选择大鼠时应注意检测血脂水平。对不同年龄的大鼠也进行了考察，发现24月龄大鼠，在补骨脂素、异补骨脂素相同的保留时间内有干扰，2月龄大鼠没有干扰。估计是老龄动物的基础代谢物质与青年动物不同造成的。对于雌鼠与雄鼠，预试验发现对补骨脂素和异补骨脂素的代谢速度不一样，具体差异尚需药代动力学进一步研究。综上所述，在测定补骨脂在体内分布及代谢时，应选用4月龄左右的大鼠，雌雄各半，同时给予低脂饲料。

本实验建立了一种快速分析大鼠体内血清、肝、肾中补骨脂药材有效成分补骨脂素和异补骨脂素含量的方法。该方法具有高灵敏度、操作简单等特点，为补骨脂药代动力学研究以及在体内各组织的分布，提供了必要的参考。

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