抑癌基因Reprimo启动子区甲基化在胃癌中表达及其临床意义*

陕西省人民医院腔镜中心( 西安 710068)

李 颖 易 默▲ 何小勤▲

抑癌基因Reprimo启动子区甲基化在胃癌中表达及其临床意义*

陕西省人民医院腔镜中心( 西安 710068)

李 颖 易 默▲何小勤▲

目的:检测胃癌中抑癌基因Reprimo启动子区甲基化状态及蛋白的表达，探讨Reprimo启动子区甲基化在胃癌发生发展中的作用及临床意义。方法:采用甲基化特异聚合酶链反应(MSP)及免疫组化(SP法)检测慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生(36例)、异型增生(23例)、胃癌(42例)标本中Reprimo基因启动子区的甲基化及蛋白表达情况，并与正常胃粘膜组织(20例)作为对照进行对比分析。结果：肠上皮化生、异型增生和胃癌中Reprimo基因启动子区甲基化阳性率依次升高。正常对照组未检出甲基化，与异型增生和胃癌相比差异有统计学意义。Reprimo基因启动子区甲基化在异型增生和胃癌中的阳性率显著高于肠上皮化生组。Reprimo蛋白表达率依次降低且明显低于正常对照组，启动子区甲基化与蛋白表达呈显著负相关。结论：在胃癌发生发展过程中Reprimo基因启动子区发生了甲基化，其高甲基化状态影响了Reprimo蛋白的表达，可能参与胃癌的发生发展，是胃癌发生的早期分子事件。

胃癌发生发展是一个多阶段、多因素参与的过程，研究胃癌发生过程中基因水平的改变，有助于探究癌变的机制及寻找胃癌早期诊断的分子标志物。近来研究表明，抑癌基因启动子区的高甲基化与基因表达缺失有关，可能是癌症发生过程中的重要机制[1]。Reprimo基因是新近发现的潜在抑癌基因，位于人类染色体2q23上，是调控细胞正常生长的基因之一。其编码的蛋白位于胞质，是一种高度糖基化的蛋白。是P53介导的细胞周期调控的下游信号，可使异常的细胞停滞在G2期，阻止细胞增殖。Reprimo启动子异常甲基化可以抑制转录，引起G2/M检查点调控发生紊乱，导致细胞异常增殖[2]。本研究采用甲基化特异聚合酶链反应MSP及免疫组化(SP法)检测经胃镜获取的病理证实的正常胃粘膜、慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生、异型增生和胃癌中Reprimo基因启动子区的甲基化状态及蛋白表达情况，旨在了解抑癌基因Reprimo甲基化在胃癌发生、发展中可能的作用。

材料与方法

1 主要仪器及试剂 Gel Doc 2000凝胶成像分析系统为美国BIO-RAD公司产品；Gene Amp PCR System 9700PCR仪为美国ABI公司产品；甲基化修饰试剂盒以及PCR试剂均为美国Zymo Research 公司产品；全自动脱蜡抗原修复液为英国Thermo Fisher公司产品；Reprimo抗体为英国Biorbyt公司产品；修复液为英国LabVision PT Module公司。

2 一般资料 选取2012年6月至2013年10月在陕西省人民医院消化内二科门诊及住院接受诊治的胃病患者101例，其中,男68例，女43例，年龄21～80岁，平均年龄(65．2±9．2)岁，所有患者均未接受放射、化学及免疫治疗。收集以上病例标本，将其分成两份：①用10%中性甲醛固定，石蜡包埋；②在20 min内保存于-80℃液氮中备用。经我院病理科证实符合入组条件标本按病理级别分为慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生36例，异型增生23例，胃癌42例，纳入本研究。20例正常胃粘膜组织取自门诊健康志愿者，本研究获所有患者和健康志愿者知情同意。

3 方 法

3.1 甲基化特异性PCR 检测Reprimo 基因启动子区甲基化

3.1.1 组织DNA提取: 组织DNA提取严格按照QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN，德国)操作说明书进行。核酸蛋白分析仪Nanodrop2000测其A值, A 260/280在1.8～2.0之间，符合纯度要求，凝胶电泳检测提取DNA的质量, 剩余DNA置于-20 ℃冻存。

3.1.2 组织DNA修饰及甲基化特异性PCR(methylationspecific PCR): 取组织DNA 500 ng, 采用EZ DNA Methylation-GOLD Kit(D5005)试剂盒(美国Zymo Research)进行DNA亚硫酸氢盐修饰与纯化,根据Zymo TaqTMPre Mix(ZYMO，美国)说明书进行PCR反应, 引物设计根据在线软件上完成，具体序列参见附表。由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。PCR反应条件: 95℃预变性5 min，95℃变性30 s， 62℃退火，72℃延伸30 s， 共42个循环，72℃延伸10 min。取PCR产物10 μl，3%琼脂糖凝胶电泳。Sss．I甲基转移酶(New England Biolabs，美国)修饰的正常人外周血淋巴细胞DNA作为甲基化阳性对照，以未经修饰的正常人外周血淋巴细胞DNA作为非甲基化阳性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照。使用BIO-RAD凝胶成像仪分析成像结果。由成像仪自带的软件对实验结果进行相对定量，计算甲基化程度。所有的甲基化扩增产物经回收纯化后用ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems，美国)进行测序分析。

附表 引物序列

MF：上游甲基化引物，MR：下游甲基化引物，UMF：上游非甲基化引物，UMR：下游非甲基化引物，M为甲基化，U为非甲基化。

3.2 免疫组织化学方法检测Reprimo蛋白表达:采取EnVision染色法检测Reprimo基因编码蛋白的表达，采用2μm厚切片，烤片1.5～2h；常规脱蜡至水，经PT Module修复，山羊血清封闭后依次滴加一抗4℃过夜，生物素化二抗室温孵育30 min，DAB显色，苏木精衬染后封片。由两位高年资病理医师独立阅片。用PBS代替一抗平行操作染色做阴性对照，用经反复验证的已知阳性片做阳性对照。以胞浆出现棕黄色颗粒为Reprimo基因阳性表达细胞，每张切片随机观察10个高倍视野(×400)，计数阳性细胞与总细胞的比值。阳性细胞<5%为阴性(-)，阳性细胞>5%为阳性(+)。

3.3 统计学方法：采用SPSS13．0统计学软件进行分析。各组病变中甲基化率及蛋白阳性表达率采用Fish确切概率或χ2检验； Reprimo基因甲基化与蛋白表达的关系采用Pearson列联系数分析。P<0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 Reprimo基因启动子区甲基化检测结果：肠上皮化生、异型增生和胃癌中Reprimo基因的甲基化率随病理级别增高均呈递增趋势。肠上皮化生、异型增生和胃癌中Reprimo基因甲基化率依次为16.7% (6/36)、30.4%(8/23)和57.1%(24/42)； 20名正常对照均未检出基因甲基化。异型增生和胃癌中Reprimo基因甲基化率高于正常对照(P<0．05)，异型增生中Reprimo基因的甲基化率和胃癌相比差异无统计学意义(P>0．05)。甲基化Reprimo基因MSP产物测序结果证实，甲基化的C由于甲基的“保护”而在亚硫酸氢钠修饰后不变，而非甲基化的C则转变为T。

(M:甲基化;U:非甲基化;Positive:阳性对照;Negative:阴性对照;H2O:蒸馏水对照;1:胃癌组织;2:异型增生;3:肠上皮化生)

图1 甲基化特异PCR检测不同组织中Reprimo结果

2 Reprimo蛋白表达情况及与基因甲基化的关系：101例患者中有61例表达Reprimo蛋白，其余40例判定为阴性，正常对照均为阳性表达(图1)。61例表达阳性组织中仅12例(19.67%)发生Reprimo基因甲基化，而40例表达阴性组织中26例发生甲基化(65.0%)。Reprimo蛋白表达与基因甲基化显著负相关(r=-0.4576，P=0．000)。

胃癌的发生发展是一个连续性过程，其中“慢性胃炎-胃粘膜萎缩-肠上皮化生-异型增生-胃癌”的发病模式已得到认可[3]。由于缺乏特殊典型症状大多数胃癌患者在确诊时已处于中晚期，胃癌的早期诊断依赖于对癌前病变的随访与追踪。

抑癌基因也称为抗癌基因。生物体内细胞在增值、分化和凋亡的过程中受到体内正性和负性两类调控信号的调节，正性信号促使细胞进入增值周期，抑制分化；而负性信号则抑制细胞增值，并促进其成熟分化。肿瘤的发生起源于细胞增值和分化调控失常，使细胞持续增值不能及时分化和凋亡。至今已发现10余种抑癌基因，Reprimo基因是新近发现的潜在抑癌基因。位于人类染色体2q23上，是调控细胞正常生长的基因之一。其编码的蛋白定位于胞质，是一种高度糖基化的蛋白。是转录调节因子P53介导的细胞周期调控的下游信号，可使异常的细胞停滞在G2期，阻止细胞增殖。表观遗传是指DNA 序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变[4]。这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，即基因型未发生变化而表型却发生了改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递[5]。决定表观遗传学过程的主要因素为DNA 修饰、组蛋白修饰以及非编码RNA 调控。表观遗传学研究包括染色质重塑、DNA 甲基化、X 染色体失活、非编码RNA 调控四个方面，任何一方面的异常都将影响染色质结构和基因表达，导致复杂综合征、多因素疾病以及癌症。DNA 甲基化是最常见的复制后及转录前修饰方式之一，在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面发挥重要作用。近期研究表明抑癌基因启动子区域CpG岛(富含双核苷酸“CG”的区域)高甲基化引起的表达沉默或下调被认为是胃癌发生的重要原因之一[6]。基因甲基化及其表达的缺失在肿瘤细胞中是一种常见的现象，可能是某些类型人类肿瘤的发生机制，这种思想指导许多学者单独对某些肿瘤在诊断、治疗与预后评估方面进行该基因的研究。Gazdar[7]等发现在多种肿瘤中Reprimo基因失活，认为DNA甲基化是其失活的主要机制，并且这种变化发生在肿瘤的早期阶段。而Bernal[8]用甲基化特异性PCR方法检测43例胃癌患者及31例健康人群胃粘膜组织及血浆样本，发现在胃癌患者组织及血浆中，Reprimo基因甲基化的检出率分别为97.7% (42 / 43) 和95.3% (41 /43)，而在对照人群中，检测率则只有9.7%。Takahashi[2]等对645例肿瘤患者(代表16个肿瘤类型)进行Reprimo基因异常甲基化情况检测,Reprimo启动子发生甲基化在胃癌癌患者中占79%。张瑜[9]等分析了Bernal和Takahashi等报道，认为Reprimo基因异常甲基化在胃癌患者中具有特异性，可作为胃癌早期发现的重要指标。

为验证抑癌基因Reprimo甲基化与胃癌发生的关系，我们采用甲基化特异聚合酶链反应(MSP)及免疫组化(SP法)连续观察从慢性胃炎-胃粘膜萎缩-肠上皮化生-异型增生-胃癌过程中抑癌基因Reprimo启动子发生甲基化阳性率及其蛋白表达。在本实验观察到Reprimo基因甲基化率从肠上皮化生-异型增生-胃癌依次增加，分别是12.5 (9/36)、28.5%(8/28)和42.8%(18/42)。肠上皮化生中只有低水平的基因甲基化，与正常对照组差异无统计学意义；而异型增生和胃癌中的甲基化率明显高于正常组织，差异有统计学意义，异型增生和胃癌中甲基化率的差异无统计学意义。由以上结果可推断Reprimo基因高甲基化在胃粘膜病变由肠上皮化生过渡到异型增生时发生了质的改变，可能是胃癌发生的早期分子事件。实验发现Reprimo启动子区甲基化与蛋白表达呈显著负相关。从免疫组化的图片中可以观察到肠上皮化生-异型增生-胃癌发展过程中细胞从阳性率高的黄染逐渐到阴性率高的淡蓝色变化过程。

综上所述，在胃癌的发生发展过程中Reprimo基因启动子区发生了甲基化，并在异性增生阶段发生了重要的变化，可能是胃癌发生的早期分子事件，为寻找胃癌早期诊断的分子标志物提供一定的理论依据。由于标本收集及实验条件的限制本实验对异型增生未能再进一步分组为轻度及中重度，对于胃癌标本未能进一步划分为早期及中晚期进行观察，对胃癌的演变过程中可能存在一定缺失，期待延长标本收集时间，扩大实验标本数量，更进一步的深入研究。

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(收稿：2014-11-25)

*陕西省科技厅社会发展攻关项目资助(2013K12-03-18)

胃肿瘤/免疫学 转录启动子 @Reprimo基因 @ 甲基化 抑制蛋白类

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.004

▲陕西省人民医院消化内二科