γ射线联合2450MHz电磁辐射对C3H10T1/2细胞生长和恶性转化的影响

西安交通大学第一附属医院(西安 710061)

刘慧娟▲ 刘 佳▲ 车 宇▲ 张晓智△

γ射线联合2450MHz电磁辐射对C3H10T1/2细胞生长和恶性转化的影响

西安交通大学第一附属医院(西安 710061)

刘慧娟▲刘 佳▲车 宇▲张晓智△

目的：观察γ射线和2450 MHz电磁联合辐射对C3H10T1/2小鼠胚芽细胞增殖能力、恶性转化、细胞周期和细胞凋亡的影响。方法：将C3H10T1/2细胞按电磁辐射强度随机分为对照组(0mW/m2)、电磁辐射低剂量组(15mW/m2)、中剂量组(30mW/m2)和高剂量组(50mW/m2)，联合组同时给予6Gy的γ射线照射。检测C3H10T1/2小鼠胚芽细胞转化、细胞周期和凋亡情况；用免疫组化和图像分析技术检测细胞Bax蛋白表达。结果：与对照组相比，单纯电磁辐射处理的细胞存活率和细胞转化未发生改变， γ射线与高剂量电磁辐射联合组存在恶性转化。γ射线组和复合组于辐射后3h S期细胞显著减少，G0/G1期细胞比例明显升高，电磁辐射组细胞凋亡率轻度增高，而γ射线组和复合组则升高较为显著，且复合组引起细胞的凋亡率升高较单纯γ射线组更明显，照射后Bax表达增强。结论：γ射线与电磁辐射复合照射后C3H10T1/2细胞发生恶性转化、细胞周期和凋亡，2450MHz电磁辐射可进一步加强γ射线对细胞恶性转化、细胞周期及凋亡的诱导作用。Bax在γ射线和2450MHZ电磁联合辐射导致C3H10T1/2细胞发生凋亡且较单纯组加重方面起重要作用。

γ射线和2450MHz电磁辐射是生活和工作环境中两种典型的辐射影响因素，其生物效应和对健康的影响一直倍受关注。但往往在进行健康危险程度评价时，都简单地假定处于某一种危害因素之中，所致的健康损害效应也是单独的。但在一些特殊职业环境如肿瘤放射治疗临床实践中，却可能存在着电离辐射和电磁辐射复合照射的情况[1]。从目前研究来看，报道不同类型辐射间的联合毒效应相对较少。本实验观察γ射线和2450MHz电磁辐射复合照射后C3H10T1/2小鼠胚芽细胞增殖能力、细胞周期、细胞凋亡和恶性转化的变化，并探讨两者之间可能的联合效应。

材料与方法

1 主要试剂和仪器 BME培养基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶、二甲基亚砜 (DMSO)、青霉素、链霉素等(上海生工)，培养皿、96孔培养板(Coming公司)、Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒(Biopec)，60Coγ射线放射源(由辐照中心提供)，微波功率场强仪(Narda公司)，流式细胞仪(Becton Dickinson公司)。

2 电磁辐射系统 2450MHz电磁辐照暴露装置由信号发生器、电磁信号功率放大器和辐照屏蔽室组成。电磁信号发生器发出的信号由功率放大器放大并输入辐照屏蔽室内，经过发射端产生电磁场。内部的电磁场功率密度由探头接收后经电脑读出。

3 方 法

3.1 细胞培养与照射分组：8克隆的C3H10T1/2小鼠胚芽细胞在含4mmol/L左旋谷酰胺和10%胎牛血清(整个实验都用同一批号的血清)Eagle氏基础培养基中(Eagle’s basal medium, BME)培养,培养箱温度保持在37℃内含5%CO2，0.05%EDTA-Trypsin消化传代。每次实验复苏一管同代冻存细胞。

将细胞随机分为对照组、15、30和50mW/m2暴露组。第2天细胞贴壁后采用60Co辐照γ射线照射，剂量率为1Gy/min(由本院辐照中心提供)，γ射线照射后放入电磁辐射辐照系统内进行辐照，2h/d，连照7d后第8天分为电磁辐射组和联合组，联合组接受6Gy的γ射线照射。细胞分组为M0组(0Gy，0mW/m2)、M1组(0Gy，15mW/m2)、M3组(0Gy，30mW/m2)、M5组(0 Gy，50mW/m2)、IM0组(6Gy，0mW/m2)、IM1组(6Gy，15mW/m2)、IM3组(6Gy，30mW/m2)、IM5组(6Gy，50mW/m2)。

3.2 细胞存活和转化分析：细胞暴露后随机分为两份:一份接种200个细胞于10cm培养皿中，共5个样本用于检测细胞毒性；另一份接种2000个细胞于10cm培养皿中，用于检测细胞转化。用含10%血清的培养液(BME-10)每周换液2次，1周左右用于检测细胞毒性的5个样本皿细胞先用PBS洗2遍，再用含10%甲醛的姬姆萨染料染色固定计数克隆。大约3～4周待细胞转化组细胞汇合，此后更换5%血清的培养液(BME-5)培养，每周换液1次，6～7周左右细胞转化组细胞用PBS洗2遍，再用含10%甲醛的姬姆萨染料染色固定计数转化灶。计算每103存活细胞转化灶的发生频率，计算公式如下:

体外细胞转化(In vitro cell transformation)是指在体外培养条件下，细胞的生长、增殖和分化等特性发生失控的变化，以及由此而导致的赘生物表象和裸鼠体内成瘤。转化灶的定义使用Reznikoff等的经典定义。每组实验至少重复3次，实验数据用邓奈特(氏)检验方差分析计算。

3.3 细胞周期测定：照射后，在每个时间点，细胞(1×106)经消化液消化后，离心，70%乙醇固定，然后PI染色，在流式细胞仪上检测细胞周期分布(应用软件名称为MedFit LT)。

3.4 蛋白杂交：各实验组细胞首先用4C的PBS缓冲液冲洗1次，接着用橡皮擦将细胞刮落于1 ml PBS中，离心得到沉淀，细胞沉淀经冷冻-解冻-冷冻几次后，在沸水中煮沸3min，最后加样于12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。电泳后，蛋白被电转移至Hybond-ECL硝化纤维素膜。膜上的非特异性部位用免疫杂交液4℃过夜进行封闭。所用抗体如下：小鼠抗Bax单克隆抗体,抗小鼠IgG辣根过样化物酶。杂交后的条带用ECL试剂盒进行显色。

3.5 流式细胞仪的凋亡测定：各实验组细胞用流式细胞仪进行细胞凋亡检测，试剂盒为Annexin-V-FLUOS。实验过程遵试剂盒说明。

结 果

1 2450MHz电磁辐射、γ射线射线单独及联合照射对细胞集落形成率的影响：与对照组M0比较，单独电磁辐射照射组M5细胞的增殖活性下降;联合组中与单独电离IM0相比，IM3和IM5组细胞的增殖活性明显下降，其中IM5组细胞的增殖活性下降尤为显著。各组细胞的增殖百分率，见表1。

2 2450MHz电磁辐射、γ射线单独及联合照射对细胞恶性转化的影响：与对照组M0比较，单独电磁辐射照射组、单独γ射线组、联合组中IM1组细胞的恶性转化改变较低，联合组中IM3和IM5组细胞的有细胞恶性转化与与对照组M0比较恶性转化增加(P﹤0.01)。各实验组细胞的恶性转化结果，见表1。

3 2450MHz电磁辐射、γ射线单独及联合照射对细胞周期分布的影响：如表2所示，未发现单独2450MHz电磁辐射暴露改变C3H10T1/2细胞的细胞周期分布。γ射线联合2450MHz电电磁辐射联合加强细胞周期阻滞于G1期和G2期效应。电磁辐射波联合γ射线照射后3 h，细胞轻微堆积于G0/G1期，G0/G1期细胞的百分比从对照组的71%增加87%。增加的幅度在照射后6h变得更明显。24h G0/G1期细胞周期恢复。微波暴露对于在24h范围内γ射线诱导的G1和G2期阻滞没有影响。

表1 2450MHz电磁辐射波、γ射线射线单独及联合照射对细胞集落形成率和细胞恶性转化的影响±s)

注：PE=集落形成率;Fi=有转化灶;Fo=无转化灶; TII= II型转化灶; TIII= III型转化灶;TII+III=II型转化灶+ III型转化灶;SE=标准误；与M0组或IM0组比较， *P<0.01

表2 2450MHz电磁辐射、γ射线射线单独及联合照射对细胞周期分布的影响±s，%)

注：与M0组或IM0组比较，*P<0.01

4 2450MHz电磁辐射、γ射线单独及联合照射对细胞凋亡的影响：如图1所示，单独电磁辐射作用不能诱导C3H10T1/2细胞凋亡。6Gyγ射线照射后24 h和72 h，只有少量细胞发生了凋亡(约占细胞总数的2%～3%)。值得注意的是，电离辐射后电磁辐射暴露24h显著促进了γ射线诱导的凋亡，凋亡细胞从约3%升至0.4%。但在72h时间点电磁辐射对凋亡的促进作用消失。

与M0组或IM0组比较，*P<0.01

图1 2450MHz电磁辐射、γ射线单独及联合照射对细胞凋亡的影响

5 2450MHz 电磁辐射、γ射线单独及联合照射对Bax的表达的影响：为了探讨电磁辐射促进γ射线诱导的细胞凋亡水平的机制，我们检测了凋亡调节蛋白Bax的表达。同凋亡的结果一致，电磁辐射暴露促进了γ射线照射后24 h Bax的表达。辐照后72 h，Bax的表达恢复到对照水平，电磁辐射暴露在72 h时间点对Bax的表达没有影响。同样，单独电磁辐射暴露对Bax的表达也没有影响(图2)。

图2 2450MHz 电磁辐射、γ射线单独 及联合照射对Bax表达的影响

讨 论

C3H10T1/2细胞是从C3H小鼠分离建立的间充质干细胞株，可分化为骨、软骨、脂肪、肌和内皮细胞，是研究细胞恶性转化的标准细胞模型，故本次实验选用此细胞系。目前有关电磁辐射和电离辐射的复合效应的报道较少，且存在不一致的结果。有学者认为，电磁辐射和电离辐射的复合效应与这两种辐射照射的条件密切相关，包括照射时间的长短及照射的先后次序等方面，在电离辐射照射后的急性作用期施加电磁辐射，可增加电离辐射效应。贾永峰等[2]研究结果显示，5.5Gy的γ射线和50 mW/cm2电磁辐射复合照射可较单纯γ射线增加小鼠的死亡率。王中和等发现[3]利用γ射线和高功率毫米波联合照射人舌癌细胞能明显抑制该细胞的克隆能力，且明显高于单纯电磁辐射和γ射线组。张卫研究显示[4]，单独电磁辐射和γ射线均能抑制SHG44细胞的生长，且电磁辐射能增强γ射线的作用。陆敏霞研究表明[5]，电磁辐射有降低细胞活力的作用，且有一定剂量相关性；高剂量微波(6mW/cm2)联合γ射线照射能降低SHG44 细胞的存活率，且损伤效应在细胞受到电离辐射后能被放大。但也有研究显示电磁辐射不仅能减轻γ射线所造成的小鼠的辐射损伤，而且能够促进放射损伤后的恢复。

电磁辐射可能的致癌效应是其生物学效应研究中的热点，近年来电磁致癌效应方面的研究越来越多，但至今仍存在分歧。Elizabeth等[6]进行过与本实验相似的实验研究，他们的研究同样选用C3H10T1/2细胞系，分别暴露于三种不同强度2450MHz电磁辐射，时间为24h，X射线为致瘤性转化激动因子，TPA为致瘤性转化促进因子，共26种不同的暴露条件，结果显示只有在TPA出现时电磁辐射会引起C3H10T1/2细胞转化频率随SAR增加而增加的剂量-效应关系。

本实验发现，γ射线和电磁辐射复合照射可诱导C3H10T1/2细胞的生长改变及恶性转化，同时还发现，在γ射线照射后即刻给予50mW/m2的2450MHz微波照射，能够进一步增强C3H10T1/2细胞的凋亡。

细胞生长和细胞凋亡密切相关。细胞生长或凋亡失控都可能通过干扰细胞更新平衡从而导致恶性肿瘤发生率的增加。本次实验结果表明单独电磁辐射(2450MHz，15、30和50mW/m2)暴露不会引起C3H10T1/2细胞的生长改变及恶性转化发生，而且单纯电磁辐射暴露也未对细胞周期分布产生影响。虽然我们的实验结果与其他大多数的研究支持电磁辐射暴露不影响细胞生长的观点，但也有相反的研究报道。

有研究显示，电磁辐射暴露能够影响γ射线或一些化学物质[6]诱导的细胞的凋亡程度，但详细机制尚不明确。有资料显示这种现象可能是由于电磁辐射参与了细胞钙离子内流的调节[7]。如果细胞通过凋亡通路清除DNA损伤细胞的能力受到破坏而导致大量受损细胞在体内存留，就会增加肿瘤发生的危险度。因此，我们观察了2450MHz电磁辐射对C3H10T1/2细胞γ射线诱导的凋亡水平的影响。虽然6Gyγ射线只诱导少量细胞发生了凋亡，但电磁辐射暴露仍会导致γ射线照射后24h细胞的凋亡水平升高，照后72 h的细胞凋亡水平恢复正常，这表明电磁辐射的暴露对γ射线的照射诱导的凋亡水平的协同效应是短暂的。

Bax是Bcl-2家族引起细胞凋亡成员之一。Bcl-2/Bax比例在细胞命运中起重要作用。Bax二聚体形成可诱导细胞凋亡；但Bax表达降低或Bcl-2表达增加，Bax与Bcl-2就会形成异源二聚体抑制凋亡的发生。许多研究表明，电离辐射可调控Bcl-2家族基因的表达。有报道显示C3H10T1/2细胞受到电离辐射暴露后可低水平表达Bax[8]。我们的实验结果与此报道一致，照射后Bax的表达是对照水平的1.2倍。在本实验中，我们发现2450MHz电磁辐射暴露增强了辐照后24h Bax的表达。考虑到在同一个时间点电磁辐射也增加了γ射线诱导C3H10T1/2细胞凋亡水平，因此提示虽然单独电磁辐射暴露对细胞生长影响较小，但它可以通过改变C3H10T1/2细胞Bax的表达途径从而影响γ射线诱导的C3H10T1/2细胞凋亡水平。

总之，γ射线和2450MHz电磁辐射复合后C3H10T1/2细胞发生明显生长改变、恶性转化及凋亡，电磁辐射对γ射线诱导的C3H10T1/2细胞损伤有协同增强作用，Bax和Bcl-2蛋白在该协同作用中发挥重要作用，联合照射后是否有其他凋亡调控基因及蛋白发挥调控作用具体途径，有待进一步深入研究。

[1] 张 卫, 曹 毅, 童 建. 微波与γ射线联合照射对细胞生长增殖的影响[J].中国职业医学, 2008, 35(3):194-196.

[2] 贾永峰，王水明，陈建魁. γ射线与微波复合作用对小鼠造血系统功能及形态学的影响[J]. 解放军医学杂志，2006，31(8)：790-793.

[3] 王中和，唐友军，周晓健. 放射联合高功率密度毫米波对人舌鳞癌细胞的协同抗瘤效应[J]. 实用肿瘤杂志，2000，15(4)：226-229.

[4] 张 卫，曹 毅，孟谦谦. 微波与γ射线联合照射对细胞生长增殖的影响[J]. 中国职业医学，2008，35(3)：194-196.

[5] 陆敏霞，曹 毅，张 卫，等.微波及γ射线单独或联合辐射对人神经胶质瘤细胞HSP70 表达的影响[J].环境与职业医学 2009,26(4)：144-147.

[6] Elizabeth K, Balcer K,George H H. Neoplastic transformation of C3H10T1/2 cell following exposure to 120 Hz modulated 2.45 GHz microwaves and phorbol ester tumor promoter[J]. Radiation Res, 1991, 126: 65-72.

[7] Ding G R, Yaguchi H, Yoshida M. Increase in X-ray-induced mutations by exposure to magnetic field (60 Hz, 5 mT) in NF-kappaB-inhibited cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,1999,276(1): 238-43.

[8] Sakakura C, Sweeney E A, Shirahama T. Overexpression of bax sensitizes human breast cancer MCF-7 cells to radiation-induced apoptosis[J]. Int J Cancer,1996,67(1): 101-105.

(收稿：2014-11-12)

Effect of cell growth and malignant transformation induced by combination of γ-ray and microwave

First Affiliated Hospital of,Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710061)

Liu Huijuan Liu Jia Che Yu et al

Objective：To investigate the interactive effects of 2450 MHz microwave and γ-rays radiation on C3H10T1/2 cells growth，malignant transformation ,Cell cycle and apoptosis．Methods：C3H10T1/2 cells were irradiated with 0，15，30，50mW/m22450 MHz microwave and 6Gy γ-ray radiation．this study was to investigate the possible effects of 2450 MHz microwave at different doses on γ-ray induced transformation in C3HlOT1/2 cells; Cell cycle and apoptosis was assessed by flow cytometry. Bax expression of cells were detected by immuocytochemical staining with image analysis．Results： Compared with control group, microwave radiation group of cell survival and cell transformation was not changed. there was a significant increase in malignant transformation at γ-ray plus microwave radiation group. cells S stages were significantly decreased，while cells in G0/G1stages were significantly increased at 3 h. Moreover，the amount of apoptosis cells in combined radiation group was more than that in γ-ray irradiation group．In the early days after irradiation，Bax protein expression was raised. Conclusion：γ-ray combined with microwave could induce malignant transformation and apoptosis of C3H10T1/2 cells，and microwave could enhance the effect of γ-ray．The expressions of Bax in harmony may play a role in apoptosis of C3H10T1/2 cell.

Gtamma rays Electromagnetic radiation Cell proliferation Cell transformation,neoplastic Apoptosis Mice

γ射线 电磁辐射 细胞增殖 细胞转化，肿瘤 细胞凋亡 小鼠

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.003

▲陕西省肿瘤医院

△通讯作者