艾拉莫德对类风湿关节炎滑膜细胞体外干预实验研究*

兰州大学第二医院风湿免疫科 (兰州 730030)

王晓元 沈海丽▲

艾拉莫德对类风湿关节炎滑膜细胞体外干预实验研究*

兰州大学第二医院风湿免疫科 (兰州 730030)

王晓元 沈海丽▲

目的：观察艾拉莫德(T-614)对类风湿关节炎(RA)滑膜细胞(FLS)体外培养时，增殖生长能力的影响，探讨艾拉莫德的对RA的治疗机制。方法：采用噻唑蓝(MTT)法和流式细胞仪观察抗风湿药物艾拉莫德T-614对RA-FLS增殖变化，T-614分为高剂量组(1000μg/ml)、中剂量组(250μg/ml)和低剂量组(5μg/ml)，干预期间通过TNF-α(10ng/ml)刺激FLS并共孵育48h，并收上清液检测IL-8水平表达。结果：高浓度组T-614较低浓度组及正常对照组对RA的FLS体外增殖具有明显的抑制作用，检测上清IL-8明显减低。结论：T-614对TNF-α刺激下的RA-FLS有抑制增殖的作用，且趋化因子IL-8分泌水平减低，提示T-614对RA滑膜炎具有的免疫抑制调控作用。

类风湿性关节炎( Rheumatoid arthritis, RA) 是一种以滑膜炎为病理基础的慢性多关节炎性的自身免疫疾病，患者关节滑膜炎严重程度与RA病情活动和预后密切相关，滑膜炎的病理表现为：血管翳生成、炎性因子分泌及骨和软骨的破坏。艾拉莫德(Iguratimod)是一具有新的抗炎和免疫调节性质的小分子，成分为两酰胺基、甲酰基和甲基苯磺胺官能团的对氧奈酮衍生物[1]。本项研究观察T-614对活动期RA患者的滑膜细胞体外培养的干预，探讨T-614抑制滑膜细胞，调控细胞因子等作用，了解T-614对RA治疗的免疫学基础，为RA患者临床用药，得到及时、准确治疗，改善预后提供依据。

对象与方法

1 研究对象 选取2013年10月至2014年2月在兰州大学第二医院就诊RA患者，行关节镜滑膜清理术5例，男性1例，女性4例，年龄42～68岁，平均年龄55.9岁，均符合1987年美国风湿病协会(ACR)修订的诊断分类标准。

2 方 法

2.1 滑膜组织的分离培养方法： 无菌条件下，将滑膜组织剪碎至1mm3小块，通过加入胶原酶(Sigma公司)37°C消化1h，离心弃去上清，再使用胰蛋白酶消化30min，过200目细胞滤网,冲洗离心弃上清。用10%FBS-DMEM培养液在37℃、5%CO2中培养箱培养12h，弃去未粘附细胞，继续培养瓶贴壁传代细胞，每3～5d换液，用0.25%胰蛋白酶EDTA消化并传代，台盼兰染色检测细胞活动大于90%以上。

2.2 RA的FLS观察：4～6代滑膜细胞与不同剂量的T-614共抚育48h，进行的苏木素-伊红染色(HE)染色，观察滑膜细胞形态。

2.3 艾拉莫德(T-614)(先声药业公司惠赠)每片25mg，粉碎后震荡20min后，溶解在2ml的DMSO中，过40μm筛网，配置成10mg/ml，分装EP管中，细胞培养适应DMEM液稀释10倍使用微孔过滤器过滤分装使用。

2.4 噻唑蓝(MMT)法细胞增殖检测：培养4-6代的RA滑膜细胞计数后，加入96孔板培养抚育24h，加入T-614浓度为：1000、250、5μg/ml，同时，加入刺激物TNF-α每孔10ng/ml(TNF-α购自Sigma分装)，设立空白和对照采用5%DMSO，共同孵育48h，MTT法测定各孔OD值，每组8个副孔，计算细胞的存活分数(Survival fraction，SF)。

2.5 细胞因子检测: 收集相应处理的滑膜细胞培养上清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)，检测细胞培养上清中的IL-8含量，具体操作按相应的试剂盒说明书进行。

2.6 统计学方法：采用SPSS18.0统计软件，两样本数据之间的比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 RA滑膜细胞染色观察：采用第4～6代滑膜细胞，具有生长突，呈梭型或者多形性，可见分裂相，核仁明显。T-614干预后滑膜成纤维细胞增殖速度明显减慢，细胞碎片和细胞核固缩，大小不等(附图)。

A:空白组滑膜细胞呈多形性，细胞核边界、核仁清楚，突触较长，生长旺盛；B：250 μg/mlT-614共培养48h后，滑膜细胞整体数量减少，少见滑膜细胞破损，细胞核明显缩小，边界不清楚，破损表现，核仁不清楚

附图 FLS的苏木素-伊红染色(×200倍)

2 T-614对RA滑膜细胞增殖的影响:T-614不同给药组浓度加入RA滑膜细胞培养后，入各组SF值下降，不同给药浓度组间比较有统计学差异。对照组与加T-614药物组均值比较有统计学差异，见表1。

表1 T-614对TNF-α诱导的RA滑膜细胞 SF的检测

与对照组比较，*P<0.05

3 上清IL-8水平：RA滑膜细胞加入T-614，不同给药组浓度，不同给药浓度比RA滑膜细胞培养48h上清，检测IL-8水平结果，对照组与加T-614药物组均值比较具有统计学差异(P<0.05)，见表2。

表2 T-614对TNF-α诱导的RA滑膜细胞培养上清液IL-8的检测

与对照比较，*P<0.05

讨 论

类风湿性关节炎(RA)是一种以滑膜炎为病理基础的自身免疫性疾病，发病2年即可出现不可逆的关节骨质破坏。关节滑膜的过度增殖是RA关节炎，RA病理表现为滑膜组织充血，细胞异常增生，形成滑膜绒毛，最终形成血管翳，侵入骨和软骨下的骨质，是造成骨质破坏的主要原因，通过探讨药物的免疫调控作用，观察抑制滑膜增殖是基础研究的重点，也是临床用药治疗的基础。T-614是一种小分子免疫制剂，在临床实验中，对减轻疾病活动，改善病情获得了很好的治疗作用。

本研究观察RA滑膜细胞的体外培养，应用T-614药物干预实验，使用滑膜细胞的炎症刺激因子TNF-α的作用下，观察其增殖特点，同时检测细胞因子IL-8分泌表达水平。之前文献报道提示，在无介质激活时，骨关节炎的成纤维滑膜细胞在体外出现增殖潜能，高剂量艾拉莫德对骨关节炎成纤维细胞分化及表达有直接抑制作用。并有报道在体外实验中，使用T-614干预滑膜成纤维细胞，发现T-614通过抑制RA-FLS的c-fos mRNA表达，具有降低FLS增殖能力作用[2，3]。本文得到结果与文献报道一致，但本实验通过TNF-α炎症刺激因子干预滑膜细胞，TNF-α是RA关节炎中最重要的致病因子，不仅具有刺激滑膜细胞增生，启动MAPKs3个亚家族成员活化，导致细胞因子网络失调，还可诱导T细胞分化，造成Th1/Th2失衡，最终关节炎症加重，与RA发表及病程密切相关[4]。通过TNF-α刺激干预培养RA成纤维滑膜细胞后，我们观察到T-614对FLS具有更为明确的抑制增殖作用，并随剂量增加而抑制作用增强。故应用T-614具有明显抑制滑膜增殖的作用，提示在临床应用中，T-614具有改善关节炎症、缓解病情的作用。

趋化性细胞因子(Chemokines ,CK)是一组由细胞核炎性细胞产生的具有多种生物学效益功能的小分子生物活性家族，白细胞介素-8(IL-8)基因于1988年克隆，IL-8是与炎症极为密切的细胞因子，中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、成纤维细胞和内皮细胞等，在外源性或内源性因子：如脂多糖，TNF-α等诱导下可生产大量IL-8以及多种免疫炎症因子，如NO、PGE-2、IL-1、IL-6等，进一步介导炎症反应，激活粒细胞发生变形、游走、趋化和聚集，在炎症部位产生侵润作用[5]。文献提示使用不同浓度IL-8作用常规培养条件下的RA成纤维滑膜细胞时，发现有直接促进其增殖作用，并与浓度呈剂量依赖性。本研究得出，随着T-614剂量增加，滑膜细胞上清的IL-8水平逐步下降，提示了T-614治疗滑膜炎的新靶点，为抑制滑膜细胞生产IL-8，从而减少了关节炎症的致病因素，同时减少滑膜细胞的增殖，在急性关节炎治疗中T-614具有积极治疗作用。

上述研究显示，RA滑膜细胞在T-614干预条件下，关节滑膜细胞的增殖水平减低， IL-8检测水平下降。提示T-614治疗RA的靶点作用可能抑制滑膜细胞增殖，同时减少IL-8关节炎致炎病因的免疫机制。

[1] 刘 丹,陈 妤,丁汉飞，等. 艾拉莫德(T-614)在类风湿关节炎基础实验与临床疗效的研究进展[J]. 中国新药杂志,2013,22(9):1052-1055.

[2] 舒 强,李兴福,侯怀水，等. 艾拉莫德对骨关节炎滑膜成纤维样细胞特性的影响[J]. 中华风湿病学杂志,2006,10(7):389-392，449.

[3] 舒 强,李兴福,刘花香，等. 类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞增殖特性的体外研究[J]. 山东大学学报(医学版),2006,11:1095-1099.

[4] 刘青松，蒋 红，唐 中.丹参对类风湿关节炎患者滑膜细胞肿瘤坏死因子α表达的影响[J].中华临床医师杂志(电子版)，2009，8(3):74-76.

[5] Juarranz M, Mihara M. The roles of interleukin-6 in the pathogenesis of rheumatoid arthritis[J]. Rheumatol(Oxford),2004,43(4):416-422.

(收稿：2014-09-09)

*甘肃省科技厅基金项目(144FKCA060)

兰州市科学技术局基金项目(2013-3-26)

@艾拉莫德 关节炎，类风湿/免疫学 滑膜 细胞增殖 白细胞介素-8/分析 体外发生

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.011

▲通讯作者