IL-1β对脓毒症新生幼鼠胼胝体内少突胶质细胞前体细胞分化成熟的影响*

解 迪， 曾红科， 陈纯波△， 邓医宇△

(1南方医科大学研究生学院， 广东 广州 510515； 2广东省人民医院，广东省医学科学院急危重症医学部，广东 广州 510080)



·论 著·

IL-1β对脓毒症新生幼鼠胼胝体内少突胶质细胞前体细胞分化成熟的影响*

解 迪1,2， 曾红科2， 陈纯波2△， 邓医宇2△

(1南方医科大学研究生学院， 广东 广州 510515；2广东省人民医院，广东省医学科学院急危重症医学部，广东 广州 510080)

目的： 探讨IL-1β对少突胶质细胞前体细胞(OPCs)分化成熟及轴突髓鞘化的影响。方法: 将出生1 d的SD幼鼠96只随机分为2组：对照组和脂多糖(LPS)组各48只。LPS组给予腹腔注射1mg/kg LPS，对照组腹腔注射等体积PBS。根据注射后时间分为3 h、24 h、3 d、7 d、14 d、28 d 6个亚组，应用双标免疫组化及Western blotting的方法观察3 h、24 h、3 d、7 d时IL-1β及IL-1受体1(IL-1R1)的表达和14 d、28 d时髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达。进行原代OPCs培养将其分为对照组、IL-1β组、IL-1β+ IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)组及IL-1Ra组。将其诱导分化3 d后利用免疫荧光及Western blotting比较4组间MBP的表达。结果: 与对照组相比，LPS注射后3 h、24 h、3 d、7 d幼鼠胼胝体小胶质细胞表达IL-1β明显增加，其受体在OPCs表达增加。LPS注射后14 d、28 d，MBP在胼胝体的表达下降。细胞实验显示原代OPCs培养诱导分化3 d后IL-1β可以抑制MBP的表达，并且可以被IL-1Ra逆转。IL-1β可抑制磷酸化ERK的表达，ERK过表达可逆转IL-1β对MBP的抑制作用。结论: 在脓毒症新生幼鼠胼胝体内IL-1β有可能通过抑制ERK通路来抑制OPCs成熟，从而导致脑白质轴突低髓鞘化。

脓毒症； 胼胝体； 白细胞介素1β

新生儿脓毒症是临床常见的疾病[1]，可引起神经系统发育不良，从而导致神经性视听障碍、认知功能障碍，严重时甚至导致癫痫和脑瘫[2-3]。脓毒症相关性脑损伤的一个重要特征是脑室周围脑白质损伤(periventricular white matter damage,PWMD)，其机制目前尚不明确，感染激发脑白质内炎症反应可能是其机制之一。PWMD的重要病理改变是少突胶质细胞的分化成熟受到抑制[4-5]。少突胶质细胞是脑内重要的髓鞘形成细胞，成熟的少突胶质细胞可与轴突形成髓鞘，保证神经信号的正确转导。它是由少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)发育而来。由于OPCs的易损性，许多因素可以影响OPCs的发育，从而导致OPCs成熟障碍和轴突低髓鞘化，影响神经信号正确传导[6]。小胶质细胞是中枢神经系统中主要的早期炎症细胞，在受到促炎刺激后，可释放大量的炎症因子，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)[7]。有研究证实，腹腔内注射IL-1β可以导致少突胶质细胞成熟障碍及低髓鞘化[8]，但IL-1β是否可直接影响和通过何种途径影响OPCs的成熟尚不清楚。本文通过建立新生鼠脓毒症相关脑损伤模型，用双标免疫组化及免疫印迹的方法观察早期IL-1β及IL-1受体1(IL-1 receptor 1，IL-1R1)的细胞定位及表达，观察轴突髓鞘化的标志蛋白——髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表达从而证实脓毒症新生幼鼠发育成熟后出现轴突低髓鞘化。为探讨这种现象背后的原因，在体外进行OPCs培养，用免疫荧光及免疫印迹的方法观察IL-1β处理3 d后OPCs中MBP的表达，从而初步探讨IL-1β对OPCs分化成熟及轴突髓鞘化的影响及潜在机制。

材 料 和 方 法

1 材料

取1 d新生幼鼠进行实验操作，实验鼠在暨南大学动物实验中心进行饲养，自然饮食。兔抗IL-1β、鼠抗硫酸软骨素蛋白多糖抗体(chondroitin sulfate proteoglycan,CSP/NG2)、小鼠抗MBP(Millipore)；磷酸化ERK1/2、总ERK1/2(CST);兔抗IL-1R1(Santa Cruz);凝集素(lectin)购自Sigma。

2 方法

2.1 实验设计 将新生的96只SD幼鼠随机分为2组，对照组和来源于大肠埃希菌 O55:B的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)组。LPS组腹腔注射1 mg/kg LPS，对照组注射等体积的PBS，每组在注射后24 h、28 d时各取6只进行灌注固定后行双标免疫组化染色，在注射后3 h、24 h、3 d、7 d、14 d、28 d时各取6只乳鼠留取胼胝体区后行Western blotting检测。

2.2 免疫荧光染色 每组动物灌流、固定后移入30%蔗糖溶液过夜。莱卡冰冻切片机-20 ℃低温取视交叉水平冠状切片，片厚10 μm。取P24 h脑切片分2组，第1组用胎牛血清封闭后，再用兔抗IL-1β(1∶100)4 ℃孵育过夜后，PBS清洗3次，每次5 min，滴加带红色荧光的Ⅱ抗工作液和lectin(小胶质细胞标志物)室温下孵育1 h。第2组切片用兔抗IL-1R1和鼠抗NG2混合孵育4 ℃过夜，漂洗，滴加驴抗鼠-FITC和驴抗兔-CY3室温孵育1 h，用抗荧光淬灭封片剂(碧云天)封片。取P28 d的脑切片用鼠抗MBP 4 ℃孵育过夜后，PBS清洗3次，每次5 min，滴加带红色荧光的Ⅱ抗工作液，室温下孵育1 h，PBS清洗3遍后，封片。在荧光显微镜(Olympus)下观察结果。

2.3 Western blotting检测 取新鲜的胼胝体用裂解液提取蛋白，测蛋白浓度，蛋白定量为50 μg后进行电泳、转膜、封闭，于4 ℃冰箱孵育兔源IL-1β抗体(1∶1 000)、兔源IL-1R1抗体(1∶200)、鼠源MBP抗体(1∶1 000)过夜。次日取出在TBST漂洗后于4 ℃冰箱孵育抗小鼠Ⅱ抗(1∶1 000)或抗兔Ⅱ抗(1∶1 000)1 h，TBST洗膜后在暗室中加入预混好的ECL发光液，压片，曝光。各蛋白条带的信号强度用Fluor Chem 8900 灰度分析软件进行分析。

2.4 体外OPCs培养及诱导分化 取出生1 d的乳鼠，取脑皮质于0.125%胰蛋白酶中消化10 min后加血清中和，接着用移液枪轻柔吹打1～2 min，静置后取上清在1 200 r/min的条件下离心5 min，弃去上清，用含10%血清的完全培养基重悬细胞，然后种至多聚赖氨酸预包被的75 cm2培养瓶。第2天完全换液，培养至第3～4天，细胞融合度达到70%时，加入少突胶质细胞增殖培养基，之后每3 d换1次液，培养至7～10 d时，可见大量的OPCs，将培养瓶置于恒温水平摇床上，37 ℃、180 r/min 1 h，以除去小胶质细胞。丢弃细胞悬液，加入增殖培养基，再在恒温水平摇床上，37 ℃、200 r/min 18～20 h。吸出悬液静置于未涂多聚赖氨酸的培养瓶内，37 ℃、5% CO2的培养箱中静置15 min，去除少量胞体较大的星形胶质细胞和成纤维细胞。吸取细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入OPCs分化培养基，重悬细胞，以1×108/m2密度接种于多聚赖氨酸包被的24孔板中用于免疫荧光；以1×1010/m2密度接种于多聚赖氨酸包被的6孔板中用于免疫蛋白印记，待细胞贴壁后进行操作。将细胞分为对照组、IL-1β组(30 μg/L)、IL-1β+IL-1Ra组(30 μg/L)、IL-1Ra组(30 μg/L)，每组的细胞数保持相同，诱导分化3 d。培养3 d后用PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min，按常规免疫荧光细胞化学方法进行MBP染色。在荧光显微镜下随意选取不同的视野拍照，进行细胞计数。提取培养3 d后的蛋白进行电泳、转膜、封闭，鼠源MBP抗体(1∶1 000)过夜，次日取出在TBST漂洗后于4 ℃冰箱孵育抗小鼠Ⅱ抗(1∶1 000)1 h、洗膜，曝光，各蛋白条带的信号强度用Fluor Chem 8900 灰度分析软件进行分析。

2.5 质粒转染 构建ERK目的基因，加载于pEGFP载体上,进行质粒转染，使用6孔板，胞数为3×105cells/well, 将4 μg DNA溶于240 μL Opti-mem无血清培养基中(A管)。将10 μL Lipofectamine 2000(Life) 溶于240 μL Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5 min(B管)。 将A、B两管混合，放置20 min(C管)。转染期间，将6孔板培养基换成无血清培养基，每孔2 mL。将C管混合液加入6孔板对应孔中，4～6 h换成有血清培养基，后续进行Western blotting实验，步骤同前。

3 统计学处理

所有数据均使用SPSS 13.0统计学分析软件分析,计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。 Western blotting数据在多组间比较时采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验方法分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 双标免疫组化及Western blotting检测IL-1β和IL-1R1的表达与定位

免疫荧光显示处理24 h后lectin标记的小胶质细胞(绿色)与炎症因子IL-1β(红色)在胼胝体的分布情况，胼胝体内小胶质细胞呈阿米巴样，此为小胶质细胞的激活态。我们可以看到lectin标记的小胶质细胞可与IL-1β的共定位情况(黄色)，说明IL-1β由小胶质细胞产生，与对照组相比，LPS组IL-1β表达水平明显升高。Western blotting结果显示在17 kD处可检测到IL-1β，且统计数据显示各时点LPS组的IL-1β表达均升高(P<0.05)，进一步验证了免疫荧光的结果，表明LPS注射后IL-1β表达确实有增高，见图1。

Figure 1.The expression of IL-1β in corpus callosum of septic neonatal rats(immunofluorescence staining，×400). Mean±SD. n=6．*P<0.05 vs control.

免疫荧光显示处理24 h后NG2标记的OPCs细胞(绿色)与IL-1R1(红色)在胼胝体的分布情况，我们可以看到NG2标记的OPCs细胞与IL-1R1的共定位情况(黄色)，说明OPCs上存在IL-1R1，与对照组相比，LPS组IL-1R1表达升高，Western blotting结果显示在80 kD处可检测到IL-1R1，且统计数据显示各时点LPS组的IL-1R1表达均升高(P<0.05)，进一步验证了免疫荧光的结果，表明LPS注射后IL-1R1表达确实有增高，见图2。

Figure 2.The expression of IL-1R1 in corpus callosum of septic neonatal rats(immunofluorescence staining，×400). Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control.

2 免疫组化与Western blotting检测MBP的表达情况

免疫组化显示处理28 d后MBP(红色)在胼胝体的分布，LPS组胼胝体内MBP表达较对照组减弱，说明LPS组胼胝体内轴突髓鞘化明显减低，Western blotting结果显示在21 kD处可检测到MBP的表达，且统计数据显示14 d及28 d LPS组的MBP表达均下降(P<0.05)，进一步说明LPS处理28 d后轴突髓鞘化减低，见图3。

3 IL-1β抑制原代OPCs的分化成熟

免疫荧光显示，诱导分化3 d后，DAPI标记的细胞核呈椭圆形，MBP标记的成熟少突胶质细胞呈中间亮、多突触样，我们可以看到MBP阳性的细胞数，与对照组相比，IL-1β组MBP阳性细胞的比例明显减少，加入IL-1Ra后(IL-1β+IL-1Ra组)MBP阳性细胞比例有所回升，结果提示IL-1β可导致少突胶质细胞分化障碍，且这种作用可以被IL-1Ra所逆转。Western blotting结果显示处理3 d后在21 kD处可检测到MBP的表达，且统计数据显示IL-1β组MBP表达下降，IL-1β+IL-1Ra组MBP表达较IL-1β组有所回升，IL-1Ra、LPS本身对MBP表达无影响。提示IL-1β可直接导致少突胶质细胞分化成熟障碍而非LPS的直接作用，见图4。

4 IL-1β在调控分化方面与ERK通道的关系

在各组处理6 h后我们可在42 kD、44 kD处检测到磷酸化的ERK1/2(phospho-ERK1/2,p-ERK)的表达，统计数据显示IL-1β组p-ERK表达下降，IL-1β+Ra组ERK表达较IL-1β组有所回升(P<0.05),提示IL-1β可抑制ERK通道的激活，且这种作用可以被IL-1Ra所逆转，在各组处理3 d后可在21 kD处检测到MBP的表达，统计数据显示IL-1β组MBP表达下降，ERK过表达组可逆转MBP下降(P<0.05)。结果提示IL-1β可能通过抑制ERK通路参与OPCs分化的调控，见图5。

Figure 3.Distribution of myelin sheath in the corpus callosum of P28 control and LPS rats (immunofluorescence staining，×40). Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control.

Figure 4.Effects of IL-1β on differentiation of OPCs (immunofluorescence staining，×400). Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control； #P<0.05 vs IL-1β.

Figure 5.Relationship between IL-1β and ERK pathway. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs IL-1β.

讨 论

LPS介导的脓毒症可引起全身炎症反应，导致多器官功能损伤，脑白质损伤是其中之一，脑白质损伤可能由脑内固有免疫或外周因子入脑所致,两者具有交叉或独立的作用。中枢神经系统的免疫过程十分复杂，其中包括炎症细胞浸润和大量炎症因子的释放[9-10]。炎症因子与其相应的受体相互作用可能介导了后续靶细胞损伤[11]。小胶质细胞是脑内的固有免疫细胞，它受到刺激后可释放大量的炎症介质如IL-1β,这可能是脑白质损伤的机制之一，我们的研究结果显示IL-1β可与活化的小胶质细胞共定位，且7 d以内的LPS组IL-1β表达明显高于对照组，这些结果提示小胶质细胞是脑内早期的炎症细胞，可早期被激活并持续释放大量的炎症介质如IL-1β，启动脑内免疫过程，这可能是脑内IL-1β的来源之一。IL-1R分为IL-1R1和IL-1R2,目前认为IL-1β与IL-1R1相互作用可导致靶细胞的功能改变[11]。为了探究OPCs上是否存在IL-1R1，我们进行进一步研究，发现少突胶质细胞前体细胞上存在IL-1R1，且LPS处理后IL-1R1表达明显升高，以上结果提示大量炎症因子IL-1β与其表达升高的IL-1R1间相互作用可能会对少突胶质细胞的发育产生影响。

为了研究LPS注射后是否会对OPCs的发育产生影响，我们发现14 d及28 d时LPS注射组MBP表达降低，这个结果提示LPS注射后导致胼胝体内轴突髓鞘化程度降低，MBP是轴突髓鞘化的标志性蛋白，也是OPCs分化成熟的标志蛋白。轴突的髓鞘化是成熟少突胶质细胞突起缠绕轴突形成的多层脂质髓鞘，此过程包括3个方面:(1)OPCs分化成熟;(2)神经元轴突成熟;(3)成熟少突胶质细胞向轴突迁移、黏附并缠绕形成髓鞘[12]。OPCs是脑内重要的髓鞘形成细胞，其分化和成熟在轴突髓鞘化中起着关键作用。成熟的少突胶质细胞由OPCs分化而来，其分化过程大致分为Pre-O-2A、O-2A progenitor、pro-oligodendroblast、immature oligodendrocyte和mature oligodendrocyte 5个发育阶段[13-14]。LPS、IL-β、IL-1R1与OPCs分化障碍之间是否存在联系，在动物体内无法探明，为了探明LPS-IL-1β-OPCs分化成熟之间是否存在特异性的联系，我们进行了体外细胞实验，探讨其可能的机制。体外细胞实验显示直接加入IL-1β可导致MBP表达明显下降，并且这种下降可以被IL-1Ra所逆转，但IL-1Ra及LPS本身对MBP表达的无影响，提示LPS可能通过IL-1β介导OPCs分化成熟障碍而非其本身。据报道ERK信号通路在少突胶质细胞分化方面起至关重要的作用[15]。因此为了探究IL-1β通过何种途径影响OPCs的成熟，我们首先检测了IL-1β对ERK通道的影响，发现IL-1β可以抑制ERK通道的激活，随后为了明确ERK通道与MBP之间的关系，我们构建了ERK目的基因转染入细胞，发现IL-1β可降低MBP及ERK的活性，与此同时提高ERK的活性可以遏制IL-1β对MBP的影响，说明IL-1β可能通过抑制ERK的活性来抑制OPCs的分化，这可能是IL-1β影响OPCs分化的机制之一。

综上所述，我们可以推测脓毒症新生幼鼠脑胼胝体内的炎症因子IL-1β可与IL-1R1相互作用从而抑制ERK通道的激活导致OPCs分化成熟障碍，最终导致轴突低髓鞘化，我们验证了脓毒症诱导的脑白质损伤的部分病理机制，并提出IL-1β对OPCs的分化成熟具有独立的作用，这对我们理解炎症诱导的脑白质损伤机制以及治疗具有重要意义。

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Effects of microglia-derived IL-1β on differentiation of OPCs in corpus callosum of septic neonatal rats

XIE Di1,2, ZENG Hong-ke2, CHEN Chun-bo2, DENG Yi-yu2

(1SouthMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofEmergency&CriticalCareMedicine,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail:gghicu@163.com;yiyudeng666@163.com)

AIM: To explore whether IL-1β inhibits the oligodendrocyte precursor cell (OPCs) differentiation and affects axonal myelination. METHODS: One-day-old SD rats were randomly divided into control group and LPS group (48 rats in each group). The rats in LPS group were intraperitoneally injected with 1 mg/kg LPS. The rats in control group were injected with an equal volume of PBS. The rats in each group were further divided into 3 h, 24 h, 3 d, 7 d, 14 d and 28 d subgroups after injection. The expression of IL-1β and IL-1R1in the rat corpus callosum at 3 h, 24 h, 3 d, 7 d was determined by double immunofluorescence and Western blotting. The myelin basic protein(MBP) expression in the rat corpus callosum at 14 d, 28 d after injection was also measured.Invitro, primary OPCs culture was performed and divided into control group, 30 μg/L IL-1β group, 30 μg/L IL-1β+IL-1Ra group and 30 μg/L IL-1Ra group. The expression of MBP in the OPCs induced differentiation for 3 d was observed by double immunofluorescence and Western blotting. RESULTS: The expression of IL-1β and IL-1R1in the rat corpus callosum at 3 h, 24 h, 3 d, 7 d after LPS injection was obviously increased and the expression of MBP in the rat corpus callosum at 14 d, 28 d in LPS group was obviously decreased compared with control groupinvivo. The level of MBP was significantly decreased after IL-1β treatment for 3 dinvitro. However, IL-1Ra (IL-1R inhibitor) reversed the down-regulation of MBP expression. IL-1β inhibited the expression of p-ERK, ERK over-expression reversed the down-regulation of MBP expression compared with IL-1β group. CONCLUSION: IL-1β inhibits the differentiation of OPCs, which may be involved in ERK pathways, thus leading to axonal hypomyelination in the corpus callosum of septic neonatal rats.

Sepsis; Corpus callosum; Interleukin-1β

1000- 4718(2015)03- 0385- 07

2014- 10- 24

2014- 12- 29

国家自然科学基金资助项目(No. 81271329;No.81471237); 2013年广东省医学科研基金资助项目(No. A2013002)

△通讯作者 Tel: 020-83827812; 陈纯波 E-mail： gghicu@163.com； 邓医宇 E-mail： yiyudeng666@163.com

R363.2; R722.13+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.001