肌球蛋白轻链激酶介导内皮细胞屏障功能变化的研究进展*

吴 洁， 张伟金， 黄巧冰

(南方医科大学 1第一临床医学院， 2基础医学院，广东 广州 510515)



·综 述·

肌球蛋白轻链激酶介导内皮细胞屏障功能变化的研究进展*

吴 洁1， 张伟金1， 黄巧冰2△

(南方医科大学1第一临床医学院，2基础医学院，广东 广州 510515)

血管内皮细胞是连续被覆于全身血管内膜的一层细胞群，不仅构成一道半选择通透性屏障，还合成和分泌多种生物活性物质，维持正常的心血管功能。血管内皮细胞的完整和屏障功能完好对于维持心血管稳态有至关重要的作用。内皮细胞受损所致屏障功能下降是血管病变的始动环节，如脑血管内皮连接受损导致的脑水肿[1]。肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)是第1个被发现的依赖于钙调蛋白(calmodulin，CaM)的丝/苏氨酸特异性蛋白激酶，随着对其结构和功能研究的深入，MLCK在介导内皮细胞通透性改变中所起的重要作用引起了广泛关注，本文就此做一综述。

1 MLCK的生化特性

1.1 MLCK家族 MLCK是免疫球蛋白超家族的一员，属于Ca2+/CaM依赖的蛋白激酶家族，由位于人类3、20、16号染色体上的mylk1～3基因编码[2]。心肌型MLCK(cardiac myosin light chain kinase，cMLCK)和骨骼肌型MLCK(skeletal myosin light chain kinase，skMLCK)分别由mylk3和mylk2编码，而平滑肌型MLCK(smooth muscle myosin light chain kinase，smMLCK)和非肌型MLCK(non muscle myosin light chain kinase，nmMLCK)则由mylk1编码[3]。cMLCK 和skMLCK的表达分别仅限于心肌和骨骼肌组织。与此相反，smMLCK普遍存在于成熟组织，以平滑肌组织含量最多。而nmMLCK又分为MLCK1～4个亚型，其中内皮细胞主要表达MLCK1和MLCK2。

1.2 MLCK的结构及功能 MLCK家族分子结构存在较大差异，但smMLCK与nmMLCK较为相似。smMLCK由1 147个氨基酸组成，分子量约为108 kD，因此又被称作MLCK108。smMLCK的N端含有1个包含纤连蛋白的结构域、2个免疫球蛋白结构域和多个磷酸化位点。nmMLCK与smMLCK的不同之处在于其N端所特有的922个氨基酸残基序列，包含 6 个延伸的免疫球蛋白结构域以及2个串联的肌动蛋白结合区。nmMLCK分子量约为210 kD，4个亚型的不同在于其组成的1 914个氨基酸序列的不同。

MLCK的主要功能是对肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)进行磷酸化，其活性直接影响肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用并引起细胞中心张力的改变，因此MLCK在肌肉收缩和细胞迁移等方面发挥重要作用。在平滑肌细胞，Ca2+与CaM的结合激活smMLCK，使得肌球蛋白头部轻链磷酸化，Mg2+-ATP酶被激活并分解ATP产生能量，促进横桥摆动，进而拖动细肌丝滑行，从而完成一次平滑肌收缩。然而，在内皮细胞和其它非肌细胞，Ca2+与CaM的结合还不足以激活MLCK，仍需要其它信号转导途径的参与[4]。

2 MLCK介导内皮细胞通透性改变的信号转导机制

血管内皮正常屏障功能的维持有赖于紧密连接(tight junction，TJ)、黏附连接(adherence junction，AJ)和细胞骨架收缩之间的动态平衡。细胞间连接提供黏附力，细胞骨架收缩形成向心力，两种力达到平衡才能维持正常的屏障功能。细胞收缩是各种原因引起屏障通透性增加的共同途径，主要受肌动蛋白和肌球蛋白的影响，二者相互作用使细胞产生收缩力，当收缩力大于黏附力时，内皮通透性增高。

作为马达蛋白的肌球蛋白II由2条200 kD的重链和4条20 kD的轻链组成，重链形成2条平行的链型结构，其氨基末端头部与ATP和肌动蛋白作用介导肌丝滑行。轻链分为2条基础性轻链和2条调节性轻链(regulatory light chain，RLC)，前者起稳定重链结构的作用，后者调节肌球蛋白的活性，而MLCK激活的正是RLC[5]。肌球蛋白的主要作用是调控细胞骨架结构并参与细胞的多种生理活动，而这些主要通过MLC的磷酸化与去磷酸化实现[6]。MLC 的磷酸化是生物屏障通透性增加的分子基础[7]，磷酸化型 MLC 通过活化肌球蛋白重链头部的 ATP 酶，产生能量介导骨架蛋白微丝滑动，促使细胞收缩和细胞间连接改变，最终细胞间隙形成，通透性增加。研究表明，许多细胞因子、炎症介质等神经及体液介质均可通过 MLC 磷酸化而引起屏障通透性增加[8-9]。在MLCK介导的内皮通透性增高中，效应分子MLC的磷酸化是关键环节，而MLCK的激活依赖于辅助因子Ca2+与CaM的结合、上游激活蛋白Src和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的作用、一氧化氮(nitric oxide, NO)与环鸟苷酸(cyclin guanosine monophosphate,cGMP)信号分子以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路的参与。

2.1 MLCK介导MLC磷酸化 MLCK介导内皮细胞通透性增加依赖于MLC的磷酸化，MLCK 通过磷酸化MLC的第18位丝氨酸和第19位苏氨酸激活肌球蛋白重链头部ATP酶，产生的能量引起内皮细胞肌动蛋白与肌球蛋白II相互作用，使得细胞收缩，细胞间隙形成，通透性增加[10]。MLC 磷酸化除了主要受 MLCK 调控外，还受到肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)的负调控[11]。MLCP 催化MLC 从磷酸化型向非磷酸化型转变，导致磷酸化型 MLC 减少，而 MLCP 活性则又受到Rho激酶(ROCK)的负调控。因此，ROCK的激活是 MLC 发生磷酸化的又一原因。

2.2 Ca2+通道 Ca2+在血管内皮的功能运行中扮演着十分重要的角色，细胞内游离Ca2+浓度的变化调节着细胞的代谢、基因表达等活动。通过与CaM结合，Ca2+是调节MLCK活性最基本的介质。Ca2+通道的激活对于细胞内Ca2+浓度的调控至关重要，因此在MLCK诱导内皮通透性增高的过程中，Ca2+通道的作用十分重要。研究指出[12]，瞬时受体电位Ca2+通道(transient receptor potential channels，TRPC)的激活能够诱导脑毛细血管内皮通透性增高，而MLCK抑制剂ML-9能够阻止TRPC的活化以及内皮通透性增高，这就说明MLCK通过TRPC的活化导致内皮通透性增高。MLCK介导的内皮高通透性也可能和钙池操纵的钙通道(store-operated Ca2+channels，SOC)的活化有密切关系。研究表明[13]，SOC通道的活化依赖于三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-triphosphate receptor，IP3R)活化所诱导的内质网钙的释放，IP3R的活化引发MLC磷酸化以及MLC磷酸化依赖的紧密连接蛋白occludin和claudin-5的磷酸化，而后二者的磷酸化是MLCK依赖性的，这提示在内皮通透性增高中，MLCK处于SOC通道的上游。然而相反的观点仍然存在，有报道指出TRPC抑制剂SKF96365能够阻止缺氧造成的鼠脑内皮细胞MLC磷酸化和通透性增高[14]。

2.3 Src Src蛋白激酶参与了内皮细胞TJ和AJ构成的蛋白形态的改变，细胞黏附力降低及应力纤维形成增多，进而导致细胞间收缩力增加和间隙增大，最终血管通透性升高[15]。酪氨酸激酶Src通过磷酸化MLCK的Y464和Y471位点从而激活MLCK，因MLCK2没有包含这2个位点的剪接变体，所以其活化作用仅限于MLCK1[16]。另有证据表明[17]，通过基因沉默、位点突变和药物抑制等方法抑制Src的表达，都能够显著减缓MLCK依赖的内皮屏障功能紊乱。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生能够直接或间接地作用于内皮细胞，使得受损的血管松弛、白细胞黏附增加和内皮通透性升高[18]。p47phox是NADPH氧化酶系统的主要成份，Src能够介导p47phox和皮层肌动蛋白(cortactin)的酪氨酸位点磷酸化，促进ROS的产生。在肺内皮细胞中，组织内氧过多会以Src依赖的方式激活NADPH氧化酶，产生ROS或超氧化物[19]。最新的研究证明，肺动脉内皮细胞中过表达的野生型MLCK会增强p47phox与cortactin在细胞外围的共定位和ROS的产生，且使用MLCK siRNA下调MLCK的表达显著抑制上述现象[20]。这个研究提示，MLCK除了可以介导MLC的磷酸化导致内皮细胞的收缩和通透性的增加，还可通过与cortactin的相互作用，为Src与NADPH等结合形成复合物并介导ROS的生成提供反应平台，进一步加重内皮细胞的损伤。

2.4 PKC PKC是一类分子量在78～90 kD的同工酶家系，是最早被确认的蛋白激酶之一。PKC被激活后移位到细胞膜对其底物进行酸化作用，其经典亚型PKCα和PKCβ诱导内皮高通透性的作用广为人知。PKC信号通路涉及细胞骨架重组和细胞收缩、Ca2+通道等多种信号转导通路。PKC与MLCK二者的活化对于炎症细胞因子诱导的高通透性缺一不可[21]。

Guntaka等[22]发现，在胆管上皮细胞，MLCK抑制剂ML-7能够显著减缓PKC诱导的屏障功能紊乱。另有研究表明[23]，ML-7能够缓解离体冠状静脉PKC激活而介导的通透性过高。这些提示PKC介导的内皮细胞通透性增高很有可能与MLCK的活化有关。研究证实，PKC活化与胞内Ca2+增多协同作用能导致人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的MLC磷酸化增多和通透性增高。PKCα与MLCK被认为是调控肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)损伤最关键的蛋白质，PKCα被激活后，引起下游骨架蛋白磷酸化，最终激活MLCK，使MLC发生磷酸化，介导肌球-肌动蛋白间相互作用，从而引起内皮细胞的收缩，最终导致细胞旁间隙形成、血管通透性增加[24]。因此认为，PKC处于MLCK上游，通过磷酸化MLCK介导内皮细胞通透性增高。

2.5 NO与cGMP NO在多条信号通路中发挥作用，不仅可与ROS结合生成ONOO-，还能够亚硝基化很多蛋白质。在导致内皮通透性增高的信号通路中，NO能够激活鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase，GC)，使得GC催化GTP转变为cGMP。 在不同类型的细胞中，cGMP通过不同的调节机制增加或者降低内皮通透性。而在MLCK依赖的内皮细胞通透性增高中，NO与 cGMP处于PKC的下游。活化的PKCα能够磷酸化内皮细胞一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的S1179位点从而将其激活，促使NO生成增多，并进一步导致cGMP生成增加。cGMP激活蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)后，通过其下游MAPK通路激活MLCK，引起MLC磷酸化和通透性增高。除此之外，cAMP也参与了cGMP对内皮细胞通透性的调节。研究显示[25]，患有肺损伤的鼠肺内皮中cGMP的产生增加会导致cAMP的水解增多，而HUVECs中cAMP的增加或减少也受cGMP浓度的影响[26]。在大多数内皮细胞中，cAMP依赖的蛋白激酶PKA能抑制MLCK活性及内皮高通透性。因此，在一些内皮系统，cGMP和PKG依赖的MLCK活化也可能通过减少cAMP和降低蛋白激酶(protein kinase A, PKA)A的活性而实现。

2.6 MAPK通路 MAPK属于丝/苏氨酸蛋白激酶，在多种受体信号传递途径中具有关键作用。细胞间信号调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)是参与细胞形态维持及细胞骨架构建最主要的MAPK 家族成员之一。研究表明，ERK能够增强内皮细胞MLCK活性和MLC磷酸化，导致细胞间连接破坏和间隙形成[27]。在人动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells，HAECs)，MLCK所介导的应力纤维形成也是 ERK依赖性的[28]。另有证据表明[29]，在HUVECs中MLCK活性受ERK-MAPK 信号转导通路调节，而Woody等[30]发现ERK2的抑制剂能有效抑制MLCK磷酸化。因此认为，ERK在MLCK诱导的内皮通透性增高中起到重要作用。

外伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)所造成的血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)功能损伤中，MLCK导致的细胞骨架重组起到关键作用。研究显示[31]，TBI发生后白蛋白能够通过p38MAPK通路激活MLCK，最终导致BBB功能紊乱。由此可见，MAPK通路在MLCK调节血管内皮通透性改变中占据重要地位。

综上所述，多种信号分子能够通过不同的通路激活MLCK，从而导致内皮屏障功能紊乱。如图1所示，MLCK介导内皮通透性增高的关键环节在于MLCK介导的MLC磷酸化。MLC同时受MLCP的负调控，ROCK则对MLCP有抑制作用。Ca2+与CaM的结合直接激活MLCK。Src通过磷酸化Y464和Y471位点从而激活MLCK。PKC不仅能够直接激活MLCK，还可以磷酸化eNOS的S1179位点从而将其激活，并导致NO、cGMP等信号分子增多，通过下游MAPK通路激活MLCK。另外，cGMP对环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的负调控及PKA对MLCK的负调控最终促进MLCK的激活，p38MAPK通路同样可以激活MLCK。

Figure 1.Main signaling pathways of MLCK-mediated endothelial barrier dysfunction.

3 展望

由此可见，MLCK通过复杂的信号转导机制，提高肌球蛋白活性，使肌动-肌球蛋白交联增加，导致细胞收缩和细胞间隙扩大，最终血管内皮通透性增加。而在内皮屏障功能紊乱和通透性增加中，MLCK介导的MLC磷酸化是细胞内众多信号转导通路的中心环节。目前已有临床研究发现[32]，MLCK可以作为急性肺损伤等疾病的相关药物作用靶点，MLCK210基因敲除或者MLCK抑制剂的使用都能够达到保护肺功能的效果。因此，MLCK将会为更多相关疾病的治疗提供可能的作用靶点，从而为患者提供更好的帮助。

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Effects of myosin light chain kinase on regulation of endothelial barrier function

WU Jie1, ZHANG Wei-jin1, HUANG Qiao-bing2

(1FirstClinicalCollegeofMedicine,2SchoolofBasicMedicalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:bing@smu.edu.cn)

Myosin light chain kinase (MLCK) activates the regulatory light chain of myosin II, and the phosphorylated myosin light chain leads to actomyosin contractile activity, as well as the cell contraction and increasing intercellular gap, which finally results in endothelial barrier dysfunction. MLCK-dependent hyperpermeability occurs in response to multiple cell signaling molecules and signaling pathways, including Ca2+, Src, PKC, NO, cGMP and mitogen activated protein kinases (MAPK). In this review, different mechanisms of endothelial hyperpermeability mediated by MLCK are discussed.

肌球蛋白轻链激酶； 肌球蛋白； 内皮细胞； 通透性

Myosin light chain kinase; Myosin; Endothelial cells; Permeability

1000- 4718(2015)03- 0572- 05

2014- 10- 22

2014- 12- 03

国家自然科学基金资助项目(No. 81370226)；广东省自然科学基金团队项目(No. S2013030013217)

△通讯作者 Tel： 020-61648465; E-mail: bing@smu.edu.cn

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.034