人类白细胞抗原B27的实验室诊断

杨霄鹏　惠玲

人类白细胞抗原B27的实验室诊断

杨霄鹏★惠玲

［摘要］强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是临床常见的一种自身免疫性疾病。90%～95% 的AS患者有人类白细胞抗原B27（human leucocyte antigen B27，HLA-B27）基因的表达，说明HLA-B27 与AS有高度关联性。因此，HLA-27的检测在AS的诊断中有很重要的诊断价值和临床意义。目前用于检测HLA-B27的实验室方法主要有微量细胞毒法（microlymphocytotoxic test，MLCT）、酶联免疫吸咐法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、流式细胞仪法（flow cytometry instrument method，FCM）、PCR等。本文将对AS的这些实验室诊断方法及其优缺点予以概述，为实验室根据自身条件选择合适的方法检测AS提供一个参考依据。

［关键词］强直性脊柱炎；人类白细胞抗原B27；实验室诊断

作者单位：兰州军区兰州总医院医学实验中心，甘肃，兰州730050

Laboratory diagnosis of human leukocyte antigen B27

YANG Xiaopeng★, HUI Lin
(Experimental Center of Medicine, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command, Lanzhou, Gansu, China, 730050)

[ABSTRACT] Ankylosing spondylitis(AS) is a common clinical autoimmune disease. There are 90%～95%of the patients with AS showed the expression of HLA-B27 gene, which suggest that HLA-B27 is strongly associated with AS. Therefore, the detection of HLA-27 has very important diagnostic value and clinical significance for the diagnosis of AS. Nowadays, the methods used for detecting the HLA-B27 include microlymphocytotoxic test(MLCT), enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), flow cytometry assay(FCM) and PCR. In this paper, the current methods for the laboratory diagnosis of AS will be reviewed to provide a reference for laboratory to select the appropriate method based on the detection of AS according to its own conditions.

[KEY WORDS] Ankylosing spondylitis(AS); HLA-B27; Laboratory diagnosis

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一类主要累及骶髂关节和脊柱关节的慢性炎症性疾病，为血清阴性脊柱关节病的原型，目前发病机制尚不明确。AS的临床诊断通常采用纽约标准或1984年纽约修订标准，但二者对影像学依赖较大，要求有肯定的骶髂关节炎。临床上满足其条件的AS病人病程均已进入中期，对治疗很不利，这是造成AS伤残率高的原因之一。早期诊断成为争取良好预后的关键。1973年Brewerton突破性地发现了与本病高度相关的人类主要组织相容性抗原HLA-B27抗原（human leucocyte antigen B27，HLA-B27）［1］。HLA-B27是人类主要组织相容性复合体的表达产物之一，位于人体第6号染色体的短臂上，在机体所有有核细胞上表达，尤其是淋巴细胞的表面表达较高。HLA-B27抗原阳性与AS呈高度相关［2］，国内学者也通过对国内不同地域、不同民族的AS患者检测HLA-B27，证实AS患者中90%以上HLA-B27抗原为阳性，而正常人群只有5%～10%的个体表达HLA-B27抗原［3－8］。由于HLA-B27在正常人群中也有表达，因此，HLA-B27阳性在AS诊断上既非必要也非充分条件。即便如此，HLA-B27对还未发展为放射学骶髂关节炎的AS患者仍然有很高的辅助诊断价值。当患者诊断为AS的可能性为50%，若患者HLA-B27为阳性，则诊断AS的概率可提高到95%左右；若该患者HLA-B27为阴性，则患AS的概率降至3%左右［9］。

HLA-B27表达与强直性脊柱炎密切相关，检测外周血HLA-B27的表达是辅助诊断强直性脊柱炎的重要手段。HLA-B27的检测方法随科学技术的发展不断进步，目前常用检测HLA-B27的方法有微量淋巴细胞毒法（microlymphocytotoxic test，MLCT）、酶联免疫吸附剂测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、流式细胞仪法（flow cytometry instrument method，FCM）、PCR等。

1 MLCT

MLCT法基本原理为：人类淋巴细胞表面HLA-B27抗原能与试剂中的相应抗体结合，在补体参与下，细胞膜被损害打孔，造成细胞死亡，死亡细胞能被伊红透过而染色。HLA-B27阴性的细胞完整不着色，用倒置显微镜观察，计数着色细胞的百分比，死细胞＞40%为阳性，死细胞＜20%为阴性，20%～40%为可疑。MLCT法检测HLA-B27阳性率各实验有所不同，有报道阳性率达91%、敏感性为80%［10－11］，也有报道其阳性率为65%、敏感性仅为13．3%［12］。大多数文献报道认为MLCT法的阳性率只能到85%左右，敏感性为74%［13－15］。造成如此大的差异主要是MLCT法需纯化和分离新鲜外周血淋巴细胞，且操作人员镜下计数时有个人主观因素，同时由于难以获得高效价的单价血清，加之HLA高度多态性影响，易出现漏检或假阳性。且MLCT方法可能会因感染等因素使细胞膜表面的B27分子的数量或结构改变以及混入红细胞而出现假阴性或假阳性的结果。但由于MLCT法所需仪器简单，试剂价格低廉，仍是许多医院的首选。

2 ELISA

ELISA法采用酶标记多克隆抗体定量检测血清中HLA-B27抗原，具有快速、简单等优点。有报道其阳性率达95%，敏感性为80．1%，特异性更是达到98．9%［16］，其指标远高于MLCT法，甚至可以和流式细胞法和PCR法相媲美；但多数报道ELISA法检测HLA-B27的阳性率为87．5%，敏感性75%，特异性90%［17－18］。由于ELISA法采用的是多克隆抗体，易与血清中的其它物质发生交叉反应，而HLA-B27的亚型又多达105种，其抗原的结合位点也不尽相同。尽管如此，用ELISA法检测HLA-B27操作简便、快速，且标本可长期冻存。若能解决其抗体效价低、重复性差等问题，并进一步降低试剂成本，特别适合于基层医院使用。

3 FCM

随着HLA-B27单克隆抗体的出现、FCM的普及，以及检测的简便、快速等优点，HLA-B27的FCM检测法开始广泛应用。目前HLA-B27检测常用的FCM试剂有2种：美国Beckman Coulter公司的HLA-B27／B7组合试剂和美国BD Bioscience公司的HLA-B27／CD3组合试剂。FCM检测HLAB27其灵敏度为96．8%，特异度为93．5%，阳性预测值89．0%，阴性预测值为98．1%［19］。

3．1 HLA-B27／B7组合试剂的主要原理

HLA-B27单克隆抗体与HLA-B7存在交叉反应，而HLA-B7相应的单抗为HLA-B7所特有，因此用HLA-B27和HLA-B7双抗体对淋巴细胞表面HLA-B27表达进行分析。HLA-B27／B7试剂检测AS患者的阳性率在91%～95%，敏感度为94%，特异度为91%［20－22］。

3．2 HLA-B27／CD3组合试剂的主要原理

多数AS患者的CD3＋T淋巴细胞上可出现HLA-B27的高表达。利用荧光标记的CD3抗体识别CD3＋T淋巴细胞，再用另一种荧光标记的HLA-B27抗体分析CD3＋T淋巴细胞HLA-B27的表达。结果判定：根据试剂盒所自带的荧光微球确定不同批号的阳性值［23－24］，由于与HLA-B7存在交叉反应，临界值±10以内的标本有假阳性的可能。研究显示HLA-B27／CD3组合试剂检测HLAB27误差率为5%，其中部分原因就是HLA-B7抗原阳性的患者，可能会给HLA-B27的判断造成误差［25］。但是也有国内学者认为此试剂盒阳性值设置过高，与国内临床不符，建议下调10左右为好［26］。因为，FCM检测HLA-B27时在应用原临界值≥147时，敏感度为81%，特异度为95%，当把临界值调整为≥140时，其灵敏度提高到92%，而特异度降低也不多［27］。由于早期诊断AS有助于早期干预治疗并改善其预后，所以，尽管调整临界值为≥140后，损失了一部分特异性，但有助于AS患者的早期诊断，有更大的临床意义。同时，调整临界值后，非AS组HLA-B27阳性率未见明显提高，仅为10．18%，与多数报道相符［28］。目前HLAB27／CD3组合试剂检测AS患者的阳性率为94～97%，敏感度88%，特异性96%，阳性预测值100%，阴性预测值86．8%［29－31］。

4 PCR法

4．1 PCR方法

等位基因序列分析表明HLA-B27的高度多态性主要位于外显子2和3上［32］。针对HLA-B27外显子2和3基因上的寡核苷酸序列多对特异性引物或探针被设计合成，可用于B27及其亚型的检测。沈静等采用PCR技术对100例AS病人进行了HLA-B27检测，其灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值达到了97．6%、100%、100%、98．3%［33］。

HLA-B27亚型在不同的种族和地区中分布情况不同。B2705亚型可见于所有人种，而B2704亚型则是中国汉族人的优势亚型。另外HLA-B27同一亚型在不同人群中与AS的关联也可不同。2705、2704、2702亚型与AS的发生呈正相关，而2703、2708、2709、2707与AS的发生呈负相关［34－35］。PCR扩增时引物能否延伸主要取决于引物3′端的1～2个碱基是否与模板配对，若不配对则引物不能延伸，因而从理论上说设计适当的等位基因特异性引物，即可区分不同的HLA-B27亚型，但HLA-B27亚型的数目已由1994年的7个增加到现在的105个，面对如此快速增加的HLA-B27等位基因，临床使用PCR法进行如此庞大的HLA-B27基因亚型测定无论从人力和物力上都不现实。更有研究表明AS的发病机制可能与HLA-B27的各亚型的共有序列有关，而不是与各亚型特异序列有关［36－37］。

4．2 HLA-B27 mRNA的检测

通过DNA序列检测HLA-B27可能无法有效区分强直性脊柱炎患者和正常人，采用定量PCR检测HLA-B27 mRNA表达可以弥补这一缺陷。Liu［38］等对15例AS患者、30例HLA-B27阳性未发病家族成员以及20例HLA-B27呈阳性的正常人进行了相关研究，他们采用反转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技术对3组对象进行HLA-B27 mRNA表达水平的检测，实验结果显示AS患者显著高于其他2组，并通过治疗前后比较证实了HLA-B27 mRNA表达水平与强直性脊柱炎疾病活动指数密切相关。而后有其它学者也证实了此结论［39－40］。徐冉行［41］对482例AS患者和100例健康人群分别用FCM法和RT-PCR进行了对比，定量PCR法检测FCM法表达为阳性组、阴性组的阳性率分别为100%、0．83%，FCM阳性患者其PCR也均为阳性扩增，拷贝数均在103～105，在80例FCM临界区内，定量PCR检测73例阳性，阳性率为91．25%，且PCR的阳性拷贝数均在103～105，其他7例却为0拷贝，和FCM相比较，FCM在临界区内表现为不确定性，是否有B7或其他抗原的干扰，FCM无法确定，而定量PCR结果却一目了然，与临床症状基本相关。

从检测方法的敏感性、特异性等指标来看，PCR是临床检测HLA-B27首选的方法，且PCR法是目前卫生部唯一开展室间质评的方法，但此方法耗时较长，需要特定的实验仪器和严格的实验条件，需省级以上卫生行政部门组织专家进行技术验收，检测人员也需要取得基因扩增技术上岗证方可参加检测工作，因此，在临床普遍开展此技术有一定的难度。

HLA-B27阳性强弱对AS的病程发展有无影响，一直有争论。AS发病与HLA-B27有剂量依存关系，即纯合子HLA-B27的人发病的危险性高，发病后病情重［36］。段萃娟等［42］认为HLA-B27抗原表达强弱与AS病程的发展并非完全一致。但此结论是建立在同一时间、不同AS患者之间HLA-B27阳性强弱的比较，缺乏同一患者时间上的纵向比较，因此其结论的可靠性值得商榷。陈睿等［43］对HLA-B27强阳性、阳性、弱阳性、阴性病人进行2年～20年随访，认为HLA-B27强阳性及阳性病人多见于男性，病情发展快，难以控制病情，且HLA-B27强阳性患者致残率高，而HLA-B27弱阳性患者多见于女性，症状一般较轻，易于控制。HLA-B27阴性病情发展慢，且易于控制发展。因此，认为HLA-B27检测虽不能作为普查项目，但作为AS的筛选项目能提高诊断的准确性。

5　总结

当前实验室针对HLA-B27检测常用的几种方法各有优劣：MLCT法使用设备简单，但敏感性较差；ELISA法因抗体效价问题，使其结果的重复性不高；FCM法敏感性高，操作简便，但其高昂的仪器价格、试剂成本限制了基层医院的使用；PCR法特异性高，标本可以长期保存，但检测环境要求严格。笔者认为，为了进一步提高AS诊断的准确性，可以利用FCM法的高敏感性进行筛选性检测，对接近临界值或临床症状明显的标本再用PCR法的高特异性加以确认。对无力购置流式细胞仪的基层医院可以采用MLCT法来检测，对疑似标本冻存，统一送有能力使用PCR法的医院进行检测。

随着各种相关细胞因子以及遗传学方面对AS发生、发展的深入研究，寻找出高特异性和高敏感性的相关指标是一个十分重要的研究方向，这将对AS的诊断、病情监测具有重大意义。

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通讯作者：★杨霄鹏，E-mail：yxp917＠163．com