核酸适配子及其在阿尔茨海默病研究中的应用

寇哲文　王家鹏　张兴梅★

核酸适配子及其在阿尔茨海默病研究中的应用

寇哲文1王家鹏2张兴梅1★

［摘要］核酸适配子是一类寡核苷酸分子，它可由指数级富集配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术筛选寡核苷酸文库而获得。适配子通过与靶分子特异结合，可起到识别或抑制靶分子生物学活性的作用。近年来，越来越多的适配子不断被应用于阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病的研究。本文将对近年来核酸适配子在阿尔茨海默病诊断和治疗的研究进展作一综述。

［关键词］阿尔茨海默病；核酸适配子；指数级富集配体系统进化

作者单位：1．南方医科大学神经生物学教研室，广东省重大精神疾病研究重点实验室，广东，广州510515 2．南方医科大学第一临床医学院，广东，广州510515

Nucleic acid aptamers and its applications in diagnosis and therapy of Alzheimer's diseases

KOU Zhewen1, WANG Jiapeng2, ZHANG Xingmei1★
(1. Key Laboratory of Psychiatric Disorders of Guangdong Province, Department of Neurobiology, Southern Medical University, Guangzhou, Guangdong, China, 510515; 2. The First Affiliated Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, Guangdong, China, 510515)

[ABSTRACT] Nucleic acid aptamers are a kind of oligonucleotides which generated by the systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) process. Aptamers can recognize or inhibit the activity of their targets by specifically binding to their targets. In recent years, aptamers have been extensively studied and used for diagnostics and therapeutics in the central nervous system including Alzheimer's diseases. In this paper, the current progresses of aptamer-based Alzheimer's diseases diagnosis and aptamer-mediated active targeting for Alzheimer's diseases therapy will be reviewed.

[KEY WORDS] Alzheimer’s disease; Nucleic acid aptamer; Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种渐进性的中枢神经系统退行性疾病，临床表现主要为记忆力衰退、认知功能障碍、人格异常等［1］。由于人口老龄化和诊断率提高，AD患者的发病人数逐年增加，已成为日益严重的社会问题。全世界AD患者的发病人数在2010年为3 600万，据预测，该数据将在2050年增至3倍［2］。AD晚期患者生活不能自理，给患者家庭及社会带来巨大的经济负担。仅2010年全球AD治疗费用约达6 040亿美元。AD已经成为严重的世界医疗问题，寻找新的致病原因和新的诊断和治疗方法非常紧迫。

AD的特征性病理表现是神经元细胞丢失、老年斑（senile plaque，SP）、神经元纤缠结（neurofib rillary tangles，NFT）等。AD的发病原因尚不清楚，目前认为淀粉样前体蛋白、淀粉样蛋白（amyloid β，Aβ）的聚积和tau蛋白的过度磷酸化是AD发病的重要原因。另外认为RNA结合蛋白TDP-43、α突触核蛋白（α-synuclein）、载脂蛋白E4（apolipoprotein E4，apoE4）及组蛋白去乙酰化酶2 （histone deacetylase 2，HDAC2）等相互作用也可能参与AD的发病［3］。对于AD目前尚无有效的根治方法，临床常用的治疗AD的N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）拮抗剂和乙酰胆碱酯酶抑制剂等药物只能暂时缓解AD的症状。

核酸类适配子具有分子小、细胞渗透性强、结构稳定、无毒性和免疫原性等特性，更适合穿过血脑屏障作用于中枢神经系统疾病。由于其独特的特性，适配子有望媲美抗体作为药物运输载体、分子探针或抑制剂等在AD的诊断和治疗中发挥作用。本文对近年来核酸适配子在阿尔茨海默病的诊断和治疗研究中的应用进行综述。

1　适配子概述

人们认识到核酸的主要功能不仅仅是携带遗传信息，例如：一些单链核酸分子具有执行各种各样细胞功能的能力。1990年Tuerk等［4］和Ellington等［5］分别报道了应用指数级富集配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术筛选到能与噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料特异性结合的RNA片段，并命名为“适配子”或“适体”。核酸适配子由寡核苷酸（DNA或RNA）组成，能以高特异性及高亲合力与靶标结合并调节靶分子或靶细胞的活性［6］。适配子可用作治疗疾病的诊断和治疗试剂，还具有运载药物等功能，所以从被发明起就引起广泛关注。

核酸类适配子结合靶分子的主要机制是单链RNA或DNA可形成多种热力学稳定的三维空间结构，如口袋、发夹、凸环、假结和G-四聚体等，这些空间结构与靶分子间通过范德华力、氢键等相互作用形成稳定的复合物。由于能够与靶分子紧密且特异地结合，适配子被人们看作一种体外合成的“抗体”，有些适配子的亲和力和特异性甚至优于抗体。

与抗体相比，适配子表现出多种优点：（1）分子量小、细胞渗透性强、结构稳定，可以抵抗还原条件。（2）无免疫原性和毒性，可作为疾病诊断和治疗的工具。（3）靶分子广泛并且结合靶分子的亲和力高、特异性强。（4）易于体外合成和修饰，可短期内批量生产，重复性好等［7］。

随着人们对适配子功能和应用研究的深入，适配子已成为在疾病的诊断及治疗方面一个引人瞩目的研究手段。适配子应用于疾病的主要作用包括：抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、抗增生、抗炎及免疫调节等［8］。近年来，适配子也越来越多地应用于中枢神经系统疾病的诊断与治疗，包括AD、脑肿瘤、朊蛋白病及重症肌无力等疾病。

2009年，研究者发现人工合成的XNA（xenonucleic acids）分子在许多关键功能上可替代DNA 和RNA［9］。这些XNA分子能与互补的RNA或DNA相结合，并且不受DNA酶和RNA酶的作用。他们还设计了可从一个DNA模板来合成XNA的多聚酶和可以反向将XNA转录成DNA的多聚酶。这一系统使得由XNA编码的信息得以复制，以及储存并遗传。2012年成功筛选到能形成特定分子结构并能与靶分子特异结合的XNA适配子［10］。对于寡核苷酸适配子，这将是一种新的研究方向。例如：其磷酸与核糖（或脱氧核糖）骨架的修饰和改变可能促进核酸类适配子的生物利用度和药物动力学，这对适配子的临床应用具有积极促进作用。

2　适配子的筛选技术——SELEX

SELEX是一种能获取与靶分子高选择、高亲和力结合的寡核苷酸的筛选技术。大多数适配子是通过SELEX技术从化学随机合成的文库容量约为1014～1016的寡核苷酸文库中筛选得到的。SELEX技术通过数轮或数十轮重复筛选，最后得到特异结合靶分子的寡核苷酸序列。每一轮筛选包括3个主要步骤：（1）结合：将靶分子与随机寡核苷酸文库进行孵育；（2）分离：形成寡核苷酸-靶标复合物与未结合的寡核苷酸分离；（3）扩增：结合的寡核苷酸序列经PCR扩增，并可制备新的筛选寡核苷酸亚库。一般经过十几轮筛选即可得到理想的具备高特异性和亲和力的适配子。随着筛选轮数的增加，可逐渐富集到与靶分子的结合亲和力逐步增加的寡核苷酸，最后进行克隆测序即可得到核酸适配子［11］。

SELEX技术具有非常广泛的靶分子，这些靶物质包括蛋白、小分子有机物、核酸、多肽、多糖类、细菌、金属离子、病毒颗粒、活细胞及组织等［12］。近年来传统的SELEX技术经过了许多改进，将亲和层析法［13］、磁性分离技术［14］、动力学毛细管电泳［15］、微流体［16］等技术方法应用到了其中。这些新方法有利于SELEX筛选中提高获得适配子的功能、增加筛选效率、减低对靶标的要求等，对促进SELEX技术的发展具有重要意义。

3　适配子在AD的治疗和诊断中的应用

3．1适配子在AD治疗中的应用

淀粉样蛋白来源于淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）。APP共有2条水解途径：一是被α-分泌酶水解，生成可溶性无毒性的分泌型APP（sAPP）；二是被β-分泌酶和γ-分泌酶的连续作用分解APP产生Aβ。由于γ-分泌酶有多个不同水解位点，可产生多种不同氨基酸长度的Aβ。其中Aβ40和Aβ42是2种主要的Aβ单体。Aβ40是人体内大脑皮质老年斑的主要组成部分，Aβ42虽只占Aβ总数的10%，但有更强的毒性和聚积能力。

在2009年筛选得到能与Aβ40结合并抑制其聚合的RNA适配子。以与胶体金毫微粒共轭的Aβ40作为靶分子筛选出了两个适配子N2和E2［17］。通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和电镜观察结果显示，适配子能够有效结合Aβ40并且抑制Aβ40的聚集。通过偶联N2适配子和姜黄素-聚乳酸聚乙醇酸（lactic-coglycolic acid-PLGA）分子，成功构造N2适配子-姜黄素-聚乳酸聚乙醇酸纳米粒子（N2-curcumin-PLGA）以增强适配子对淀粉样蛋白的结合能力［18］。结果表明N2适配子-姜黄素-聚乳酸聚乙醇酸纳米粒子能够有效促进淀粉样蛋白的解聚。同时纳米粒子修饰可以作为一个潜在的工具来加强适配子与靶分子的结合能力，为适配子治疗AD的研究提供了新的方法。

将Ru（II）（多吡啶；4，4′-二甲基-2，2′-联吡啶；4，4′-二羧酸-2，2′-联吡啶，吩嗪；二吡啶吩嗪）化合物与有效结合Aβ单体RNA适配子进行连接，形成适配子-Ru（II）复合物［19］。当荧光标记的适配子-Ru（II）的复合物与Aβ单体共同孵育时，研究人员们发现复合物的发光强度会降低，表明此复合物可用于AD患者的早期检测。同时还发现适配子-Ru（II）复合物能有效降低Aβ的聚集和纤维状缠结，所以适配子-Ru（II）复合物将有可能被运用于AD的治疗。

除了Aβ以外，β-淀粉样前体蛋白裂解酶1也是AD治疗的重要靶标。β-淀粉样前体蛋白裂解酶1（beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1），也称β-分泌酶1（β-secretase 1），是脑内最主要的β-分泌酶，是Aβ产生过程中的限速酶。目前已发现在AD病人尸检脑组织中，BACE1的表达和活性增高。抑制BACE1活性可减轻小鼠脑内的Aβ含量。因此BACE1是治疗AD的重要靶标。BACE1的酶活性位于胞外结构域，其中有一个短小的胞质尾区B1-CT（BACE1 cytoplasmic tail）。B1-CT为两种蛋白质提供了结合位点，其中包括CCS蛋白结合位点（copper chaperone for superoxide dismutase-1，CCS）、GGA1结合位点（golgi-localized，g-ear-containing，ADP ribosylation factor-binding，GGA1）以及一个磷酸结合位点，其中GGA1和磷酸结合位点控制BACE1的运输。2006年成功筛选得到能与B1-CT位点结合的RNA适配子［20］。适配子可特异性地干扰了CCS的补充，但仍允许GGA1的正常结合和磷酸位点的正常磷酸化。因此RNA适配子只抑制B1-CT的活性而不影响BACE1在细胞间的运输，对促进B1-CT位点对AD的作用机制的研究，并有可能有潜在的治疗作用。

筛选针对AD发病机制中重要蛋白的适配子可对AD的发病机制及其治疗提供有用的工具。适配子本身分子小、穿透能力强、易修饰和合成等特点使得适配子有可能被开发成治疗AD的先导药物。近年来随着适配子纳米修饰等技术的进展，进一步推动了适配子的临床应用研究。

3．2适配子在AD诊断中的应用

传统检测AD的方法包括利用脑部正电子发射型计算机断层显像（positron emission computed tomography，PET）和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）等影像学技术，也可运用脑脊液分析技术等蛋白质组学分析技术。已经筛选得到的适配子可特异性结合Aβ40和Aβ42等多种分子，所以适配子也可应用于AD患者的诊断检测。

至今已有大量文献报道利用影像学方法诊断AD的方法。这些方法依赖于小分子标记物或者荧光标记蛋白做显像剂。荧光标记的抗体也可以作为显像剂，但因其具有免疫原性从而易引起生物学反应，影响显像水平，所以并不是最理想的显像剂。寡核苷酸适配子具有分子量小、靶向性好、易合成、无免疫原性等特点，为基于适配子的显像剂的发展提供了潜在可能性。2013年，研究者利用SELEX技术构造了一个可特异性结合Aβ的荧光标记的RNA适配子β55［21］。β55可结合AD患者和APP／PS1转基因小鼠的脑组织Aβ。荧光标记的β55可有助于显示Aβ低聚物的定位，此显像剂可用于AD的PET或MRI检测。

蛋白质组学检测脑脊液成分的方法也可应用于检测AD。但是因其取样难度高，费用昂贵，样品用量多而受到限制。2014年，有学者［22］将适配子应用到生物芯片中，并且成功将检测样品由脑脊液换成血浆。结果表明，利用适配子的蛋白质组化检测技术通过血浆样品来检测AD，其灵敏度可达90．1%，特异性可达84．2%。这项技术若能用于临床，将有助于降低AD的检测成本、减轻测试者痛苦、提高AD检测的准确率。

α-突触核蛋白是一种在中枢神经系统突触前及核周表达的可溶性蛋白质，它与帕金森病的发病机制和相关功能障碍密切相关，是路易小体的主要成分。研究发现α-突触核蛋白正常、错误折叠及其寡聚化之间存在平衡关系，当这种平衡被打破后原纤维迅速聚集成大分子、不溶性的细纤维。2012年利用凝胶迁移阻滞法与竞争筛选法成功得到能与α-突触核蛋白寡聚物结合的DNA适配子［23］。在筛选适配子的过程中，研究人员将寡聚体态、单体态以及纤维态的α-突触核蛋白固定在硝酸纤维膜上，并让DNA文库与各种状态的α-突触核蛋白结合，最终获得能与寡聚体态的α-突触核蛋白结合的DNA适配子。结果显示被筛选出来的DNA适配子也能与Aβ40寡聚物结合，有可能被运用到AD疾病的诊断和治疗。

适配子作为可与抗体相媲美的小分子物质，还具有某些优于抗体的特性，比如：体外筛选即可得到，不需要进行动物免疫；免疫原性低；毒性低；分子小；易于合成、修饰和储存；有毒分子也可筛选得到适配子等。这些特点有利于适配子在疾病（包括AD等）诊断方面会有越来越多的应用。

4　总结和展望

适配子作为药物和诊断试剂具有分子小、特异性高、亲和力高和无毒、细胞穿透力强、无免疫原性等特点，适用于中枢神经系统疾病尤其是AD的诊断和治疗。从适配子被发现至今，相关技术发展迅猛，相关的研究成果很多。可以预言，基于适配子的诊断和治疗技术可能会与抗体一样成为重要的生物技术之一。然而目前适配子作为临床药物制剂在体内的作用仍存在靶标筛选方法自动化低、体内药物稳定性等问题；作为诊断试剂，其准确度和灵敏度还有待进一步提高。相信随着适配子研究的深入，适配子将会在AD等神经退行性疾病的诊断与治疗方面发挥更大的作用。

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通讯作者：★张兴梅，E-mail：zxmray＠hotmail．com

基金项目：国家自然科学基金（81471388）；广东省自然科学基金（2014A30313351）