槲皮素二水对多柔比星抗肿瘤的增效及减毒作用研究*

朱建立，叶启霞，赵 阳，权松霞，温战迎，王巨才，何美霞

(1.郑州大学医药科学研究院药理研究室，河南 郑州 450052； 2.郑州大学第一附属医院肾内科，河南 郑州 450052； 3.海南省食品药品检验所，海南 海口 570216)

·实验研究·

槲皮素二水对多柔比星抗肿瘤的增效及减毒作用研究*

朱建立1，叶启霞1，赵 阳1，权松霞2，温战迎1，王巨才3，何美霞1

(1.郑州大学医药科学研究院药理研究室，河南 郑州 450052； 2.郑州大学第一附属医院肾内科，河南 郑州 450052； 3.海南省食品药品检验所，海南 海口 570216)

目的：了解槲皮素二水与多柔比星(doxorubicin，ADM)联合用药后能否增强多柔比星的抗肿瘤作用，并且观察槲皮素二水能否减低多柔比星对心脏的毒副作用。方法：增效作用采用槲皮素二水不同剂量与多柔比星联合用药，以荷动物移植性肿瘤肝癌(H22)小鼠模型观察其对小鼠生命延长率的影响，以荷动物移植性肉瘤实体型(S180)小鼠模型来观察其对抑瘤率的影响；减毒作用研究采用家兔多柔比星心肌损伤模型，观察槲皮素二水治疗后外周血心肌酶谱：肌酸激酶(CK)、CK同工酶MB亚型(CK-MB)、C-反应蛋白(CRP)、乳酸脱氢酶(LDH)和谷草转氨酶(AST)的变化。结果：增效作用显示槲皮素二水(100 μg/g)合用多柔比星与模型对照组对比，能明显延长荷H22腹水瘤小鼠的生存时间，并对小鼠S180实体瘤有明显抑制作用；与单用多柔比星组对比，抑制对荷H22腹水瘤小鼠的生存时间有延长趋势,S180实体瘤作用显著增强。减毒作用显示槲皮素二水治疗组与模型对照组对比， CK、CK-MB、CR、 LDH和AST均有降低，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论： 槲皮素二水与多柔比星联合用药能明显增强多柔比星对小鼠H22腹水瘤和S180实体瘤的抑制作用，并对多柔比星所致家兔心肌功能损伤有明显保护作用。

槲皮素二水/药效学；多柔比星/药效学；肿瘤/药物作用；增效作用；减毒作用

槲皮素及其衍生物是含有多种生物活性的黄酮类化合物，广泛存在于植物界，多以苷的形式存在于多种植物的根、茎、叶、果实中，如荞麦、沙棘、山楂、洋葱、槐米、三七、银杏等，其中以槐米含量最高， 4%左右。近年来的研究表明：槲皮素及其衍生物有较强的抗肿瘤作用和较强的心血管保护作用[1-2]。多柔比星(doxorubicin，ADM)抗瘤谱较广，在临床上用于多种肿瘤的治疗[3-4]，一般作为二线药物，被认为是治疗晚期乳腺癌的标准药物，但其诱导的心肌毒性引起的高死亡率是肿瘤内科领域需要研究的重要课题。本研究采用体内抗动物移植性肿瘤的实验方法，研究槲皮素衍生物之一槲皮素二水和ADM联合用药的抗肿瘤作用，以及槲皮素二水对ADM所致心肌毒性的减毒作用，以期为槲皮素及其衍生物更广泛地应用于临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 瘤 株

小鼠移植性肿瘤模型包括肝癌(H22)和肉瘤实体型(S180)，由郑州大学医药科学研究院药理研究室接种传代保种。

1.2 动 物

昆明种小鼠，SPF级，雄性，体质量18.0～22.0 g，由河南省实验动物中心提供，许可证号为SCXK(豫)2005-0001。日本大耳白家兔，普通级，雌雄各半，体质量1.7～2.5 kg, 由河南省实验动物中心提供,许可证号为SCXK(豫)2005-0002。动物饲养温度为(22±1)℃，12 h人工循环照明(早8点到晚8点为光照期)，自由摄食、饮水。

1.3 药品与试剂

槲皮素二水， Sigma公司产品，批号Q0125；注射用盐酸多柔比星，浙江海正药业股份有限公司产品，批号100501。心肌酶谱检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，批号20101130。

1.4 对小鼠肝癌(H22)生命延长率影响的实验

将小鼠随机分为6组，每组动物10只。分别为：模型对照组[生理盐水0.2mL/(只·d) ip], 单用ADM组[2.0μg /(g·d )ip][5], 单用槲皮素二水低剂量组 [20.0μg /(g·d )ip],槲皮素二水高剂量组[100.0μg /(g·d )ip][6], 槲皮素二水低剂量+ADM组[20.0μg /(g·d )ip +2.0μg /(g·d )ip]；槲皮素二水高剂量+ADM组[100.0μg /(g·d )ip +2.0 μg /(g·d )ip]。无菌抽取生长良好的第10天瘤源鼠腹水，以腹水︰生理盐水1︰4比例稀释，0.2 mL/只接种于受试鼠腹腔，次日开始按拟定计量用药，连续用药10 d ,停药观察60 d。用药及停药观察期间记录动物死亡情况，以如下公式计算生命延长率(%)。生命延长率=(给药组平均存活天数-模型组平均存活天数)/模型组平均存活天数×100%。

1.5 对小鼠肉瘤(S180)抑瘤率影响的实验

实验分组同上。无菌剥离生长良好的第10天瘤源鼠实体瘤，以腹水︰生理盐水1∶4比例稀释制成瘤细胞悬液，按0.2 mL/只接种于受试鼠右侧腋下皮下，次日开始用药，连续用药10d后停药。停药后第2天，体外测瘤体体积，计算抑瘤率(%)。抑瘤率=(模型组平均瘤体体积-给药组平均瘤体体积)/ 模型组平均瘤体体积×100%。剥离瘤体称量质量，计算抑瘤率(%)。抑瘤率=(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)/ 模型组平均瘤重×100%。

1.6 对家兔ADM心肌损伤模型影响的实验

心肌损伤模型的建立：取家兔12只，每只兔自耳缘静脉注射ADM 10.0μg/g[7],2周后重复1次。将模型动物分为模型对照组和槲皮素二水组，每组6只。模型对照组以生理盐水10.0 mL/兔ip,每周1次， 连续4周；槲皮素二水组以槲皮素二水药液100.0 μg/g ip，每周1次，连续4周。第五周取家兔耳缘静脉血检测肌酸激酶(CK)、CK同工酶MB亚型(CK-MB)、C-反应蛋白(CRP)、乳酸脱氢酶(LDH)和谷草转氨酶(AST)，操作严格按试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 对小鼠肝癌(H22)生命延长率的影响

各用药组与模型对照组对比：单用ADM组、单用槲皮素二水高剂量组、槲皮素二水低剂量+ADM组、高剂量+ADM组小鼠生存时间明显延长,差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与单用ADM组对比：槲皮素二水低剂量+ADM组和高剂量+ADM组小鼠生存时间未见明显延长，差别无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组肝癌(H22)小鼠生存时间、生命延长率对比 ±s

注：与模型对照组对比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 对小鼠肉瘤(S180) 抑瘤率的影响

2.2.1 瘤体体积与抑瘤率

各用药组与模型对照组对比：单用ADM组、槲皮素二水低剂量+ADM组、高剂量+ADM组呈现明显抑瘤作用，差别有统计学意义(P<0.01)。与单用ADM组对比：槲皮素二水高剂量+ADM组抑瘤作用呈现明显增强，差别有统计学意义(P<0.05)。见表2。

组 别剂量/(μg·g-1)瘤体体积/cm3抑瘤率/%模型对照组1.13±0.19单用ADM组2.00.74±0.2**34.5单用槲皮素二水低剂量组20.00.99±0.1912.4单用槲皮素二水高剂量组100.00.85±0.2524.8槲皮素二水低剂量+ADM组20.0+2.00.67±0.18**40.7槲皮素二水高剂量+ADM组100.0+2.00.48±0.10**#57.5

注：与模型对照组对比，**P<0.01；与单用ADM组对比，#P<0.05。

2.2.2 瘤体质量与抑瘤率

各用药组与模型对照组对比：单用ADM组、槲皮素二水高剂量组、槲皮素二水低剂量+ADM组、高剂量+ADM组呈现明显抑瘤作用，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与单用ADM组对比：槲皮素二水高剂量+ADM组抑瘤作用呈现明显增强，差别有统计学意义(P<0.05)。见表3。

组 别剂量/(μg·g-1))瘤体质量/g抑瘤率/%模型对照组2.43±0.23单用ADM组2.01.50±0.49**35.8单用槲皮素二水低剂量组20.02.06±0.4015.1单用槲皮素二水高剂量组100.01.71±0.57*29.7槲皮素二水低剂量+ADM组20.0+2.01.41±0.44**42.1槲皮素二水高剂量+ADM组100.0+2.00.98±0.20**#59.8

注：与模型对照组对比，*P<0.05,**P<0.01； 与单用ADM组对比，#P<0.05。

2.3 对家兔ADM心肌损伤的影响

治疗组与模型对照组对比：心肌酶谱中CK、CK-MB、LDH和AST各指标均明显下降，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表4。

组 别CK/(U·L-1)CK-MB/(U·L-1)LDH/(U·L-1)CRP/(mg·L-1)AST/(U·L-1))模型对照组1785.0±229.52788.3±418.7617.3±104.11.45±0.1146.2±9.5槲皮素二水组1029.2±252.4**1995.8±464.3*516.2±82.5*1.43±0.1629.5±7.4*

注：与模型对照组对比，*P<0.05,**P<0.01。

3 讨 论

多柔比星是蒽环类抗肿瘤抗生素，其分子中有脂溶性的蒽环配基，具有很强的药理活性[8]。ADM对RNA的抑制作用最强。作为第二线药物，如何提高其抗肿瘤活性是笔者的研究目标之一。另外，ADM使用的累积剂量一旦大于其限制剂量(>550 mg/m2)，由其诱导的心肌损伤就易导致患者心肌坏死，甚至出现充血性心力衰竭而发生死亡，特别是近年来ADM/PTX(紫衫醇)方案在晚期乳腺癌中的应用，心肌毒性反应率增加。ADM具有剂量依赖性的心脏毒性的特性限制了其临床应用，因此从中草药中寻找降低心脏毒性的药物具有极重要的现实意义。

槲皮素的化学名为3,3′,4′,5,7-五羟基黄酮,具有多种生物活性[9-10],如扩张冠状动脉、降低毛细血管通透性和脆性、抗血小板聚集、抗病毒、抗过敏、镇痛、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用。近年来,对槲皮素的研究结果引起了国内外学者越来越多的关注,特别是在槲皮素抗肿瘤和保护心肌作用方面作了大量的研究，发现槲皮素能抑制多种肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡；能逆转肿瘤细胞的多药耐药[11]。槲皮素的水溶性较差，而槲皮素二水的水溶性较好，考虑实验中给药方式为腹腔注射，故选用槲皮素二水来观察其药理活性。本研究发现：槲皮素二水(100 μg/g)合用ADM，能明显延长荷H22腹水瘤小鼠的生存天数，对小鼠S180实体瘤有明显抑制作用；与单用ADM组对比，抑制S180实体瘤作用显著增强。有关槲皮素可增强其他抗肿瘤药物作用的敏感性已有文献报道，如槲皮素预处理的HL60和L1210白血病细胞能增强顺铂诱导的凋亡作用[12]。槲皮素发挥增效作用可能的机制是:提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性；使肿瘤细胞停留在对化疗敏感的细胞周期;降低药物在人体内及细胞内的降解速度；提高药物对肿瘤组织的针对性分布及摄取率；提高正常组织对药物副作用的抵抗力。本研究还发现:槲皮素二水对多柔比星导致的家兔心肌功能损伤有明显保护作用。文献报道:槲皮素能从不同角度保护心肌，如预先用槲皮素孵育体外培养的心肌细胞,可拮抗阿霉素对心肌细胞的损伤[13];槲皮素能防止药物诱导的大鼠心肌线粒体酶如ATP酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶的变化,并能完全阻止DNR诱导的心肌线粒体外膜荧光的变化[14]。

综上所述，槲皮素二水对多柔比星抗肿瘤作用有明显的增效及减毒作用。这为新辅助化疗的联合用药进一步研究奠定了一定的基础，也表明开发槲皮素具有潜在的社会效益和经济效益。

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(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)11-0066-04

R284

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.11.32

何美霞,研究员,hmx@zzu.edu.cn

河南省公益科研院所预研项目 (09yy0036)

2015-06-09；

2015-09-09