益气养阴方对宫颈癌大鼠免疫功能及癌组织的影响

赵向荣 牛广旭 张小辉

摘要 目的：探讨益气养阴方对宫颈癌大鼠免疫功能及癌组织P16、Ki67、P53、Survivin表达的影响。方法：采用右前腋下接种宫颈癌细胞U14的方法构建宫颈癌大鼠模型，将宫颈癌大鼠随机分为模型组、低剂量实验组和高剂量实验组，每组12只。低剂量实验组和高剂量实验组大鼠分别灌胃益气养阴方0.435、1.36 mL/kg/d，模型组灌胃等量生理鹽水，连续干预30 d。采用流式细胞仪检测大鼠外周血免疫性T细胞亚群;采用HE染色与Wb法分别检测癌组织病理学变化与P16、Ki67、P53、Survivin蛋白表达。结果：与模型组比较，低剂量实验组和高剂量实验组大鼠外周血CD3+、CD4+、NKT细胞比例及癌组织P16、P53蛋白相对表达量均升高，高剂量实验组高于低剂量实验组;CD8+细胞比例、肿瘤重量与体积及癌组织Ki67、Survivin蛋白相对表达量均降低或缩小，高剂量实验组低于或小于低剂量实验组（P<0.05）;且高剂量实验组的抑瘤率高于低剂量实验组（P<0.05）。结论：益气养阴方可有效上调宫颈癌大鼠癌组织P16、P53蛋白表达，下调Ki67、Survivin蛋白表达，从而抑制肿瘤生长，同时改善免疫功能，发挥治疗宫颈癌的作用。

关键词 宫颈癌;益气养阴方;免疫功能;癌组织;抑瘤率

Abstract Objective：To investigate the effects of Yiqi Yangyin Formula on the immune function and the expression of P16， Ki67， and P53， Survivin in cancer tissues of cervical cancer rats. Methods：The cervical cancer rat model was constructed by inoculating cervical cancer cells U14 in the right anterior armpit， and the cervical cancer rats were randomly divided into a model group and a low/high dose experimental group， each with 12 rats. Rats in the low/high-dose experimental group were given 0.435 and 1.36 mL/（kg·d） of Yiqi Yangyin Formula， respectively by gavage， and the model group was given the same amount of normal saline for 30 days. Flow cytometry was used to detect the peripheral blood immune T cell subsets in rats; HE staining and Wb method were used to detect the pathological changes of cancer tissues and the expression of P16， Ki67， P53， and Survivin protein， respectively. Results：Compared with the model group， the ratio of CD3+， CD4+， NKT cells and the relative expression of P16 and P53 proteins in the peripheral blood of rats in the low/high-dose experimental group were increased. The high-dose experimental group was higher than the low-dose experimental group; CD8+ cell ratio， tumor weight and volume， and the relative expression of Ki67 and Survivin protein in cancer tissues were reduced or shrunk. The high-dose experimental group was lower or lower than the low-dose experimental group（P<0.05）; and the tumor suppression rate of the high-dose experimental group was higher than that of the low-dose experimental group（P<0.05）. Conclusion：Yiqi Yangyin Formula can effectively up-regulate the expression of P16 and P53 protein in cervical cancer tissues， and down-regulate Ki67， Survivin protein expression， inhibit tumor growth， improve immune function， and play a role in treating cervical cancer.

Keywords Cervical cancer; Yiqi Yangyin Formula; Immune function; Cancer tissue; Tumor inhibition rate

中图分类号：285.5;R273文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.013

宫颈癌是指发生于宫颈阴道部或移行带鳞-柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌，且呈年轻化与上升趋势，严重危害女性的生命健康[1-2]。传统的治疗方案如手术、放疗、化疗等由于不良反应大、损伤机体的免疫功能等問题，在临床应用中受限。中医学理论认为癌症的发生与机体邪气入侵、体内正气虚弱有关，中医药具有调理机体内环境，抑制细胞因子，增强机体免疫力等作用[3]。益气养阴方是临床治疗肿瘤的常用药物之一，该方可通过提高机体免疫功能、诱导肿瘤细胞凋亡等抑制肿瘤生长[4]。本研究通过建立宫颈癌大鼠模型观察益气养阴方改善机体免疫功能的效果及对癌组织P16、Ki67、P53、Survivin表达的影响，旨在寻求治疗宫颈癌的新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与宫颈癌细胞株 U14 SPF级、昆明雌鼠，6周龄，体质量20～22 g，购于河北省实验动物中心，合格证号SCXK（冀）2018-004。饲养环境和条件：饲养于河北医科大学实验动物中心屏障环境动物实验室，每笼5只，温度（25±2）℃，湿度（55±2）%，光照明暗时间比为12 h/12 h，自由获取食物和水。

宫颈癌细胞株U14，由中国医学科学院药物研究所提供。培养条件[5]：将复苏的宫颈癌细胞株U14置于RPMI-1640完全培养液中，于37 ℃、5% CO2环境培养24 h，待细胞处于对数生长期终止培养，以1 200 r/min，离心半径8 cm，离心10 min，制备1×107个/mL的宫颈癌U14细胞悬液，待用。

1.1.2 药物 益气养阴方（黄芪15 g、太子参15 g、白术10 g、茯苓8 g、生地黄10 g、黄精7 g、天门冬10 g、麦门冬10 g、玄参15 g、小蓟10 g、墨旱莲10 g、女贞子10 g、白花蛇舌草15 g、半枝莲10 g、蒲公英5 g），所有饮片均购自本院中药房。

1.1.3 试剂与仪器 流式细胞仪检测试剂盒（批号：180409）、兔抗鼠CD3+、CD4+、CD8+（批号：170912）、自然杀伤性T细胞（NKT）单抗（批号：M180702），均购自美国BD公司;兔抗鼠P16抗体（批号：D180620）、兔抗鼠P53抗体（批号：D180803），均购自英国Abcam公司;兔抗鼠Ki67、Survivin抗体（批号：H180814、H180811），购自美国Cell Signaling Technology公司等。

FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司，型号：MSD100）;Couvter型高速冷冻离心机（美国Beckman公司，型号：MST-D1200）;HM355S型石蜡切片机（德国MeKa公司，型号：GLS-D5100）;CX21型光学显微镜（日本Olympus公司，型号：JSD-C1511）;Spectra Max M5型多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司，型号：MSL-C9810）;QuantityOne 1-D软件（美国Bio-Rad公司，型号：KSS-H1910）等。

1.2 方法

1.2.1 模型建立[6]与分组 采用大鼠右前腋下接种宫颈癌细胞U14的方法诱导构建宫颈癌大鼠模型，取0.2 mL细胞悬液接种于大鼠右前腋下，待有明显肿瘤结节，肿瘤直径达到约1 cm为宫颈癌大鼠模型建立成功。将成功构建的宫颈癌大鼠随机分为模型组、低剂量实验组、高剂量实验组，每组12只。

1.2.2 干预方法 低/高剂量实验组大鼠分别予益气养阴方0.435、1.36 mL/（kg·d）（生药含量为2.0 g/mL）灌胃，模型组在同时间点予等量生理盐水灌胃，连续干预30 d。

1.2.3 流式细胞仪[7]检测大鼠外周血免疫性T细胞亚群 末次给药后，禁食12 h，采集各组大鼠静脉血3 mL至流式管中，分别加入50 μL乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血和10 μLCD3+、CD4+、CD8+、NKT单抗，避光孵育20 min;加入2 mL溶血素，避光孵育20 min，2 000 r/min，离心半径8 cm，离心10 min，弃上清;加2 mL磷酸缓冲盐溶液（PBS）混匀，离心弃去上清，加2 mLPBS重悬混匀后，采用流式细胞仪分析外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+和NKT细胞比例。

1.2.4 检测各组肿瘤体积和重量 采血后过量麻醉处死各组大鼠，将肿瘤完整剥离取下，用游标卡尺测量肿瘤的长径a和短径b[8]，计算肿瘤体积：V=a×b2/2;同时测量肿瘤重量，计算平均值及抑瘤率，抑瘤率=（模型组瘤重-实验组或阳性对照组组瘤重）/模型组瘤重×100%。

1.2.5 苏木精-伊红（HE）染色[9]观察癌组织病理形态学变化 肿瘤剥离称重后，4%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、连续切片（约4 μm），行HE常规染色，光学显微镜下观察癌组织病理学形态。

1.2.6 蛋白免疫印迹（Wb）法[10]检测癌组织P16、Ki67、P53、Survivin蛋白表达 取液氮中保存的癌组织，提取总蛋白，并进行蛋白定量。蛋白经电泳分离后，转膜、封闭1 h。分别加入一抗（兔抗鼠P16、P53抗体，兔抗鼠Ki67、Survivin抗体），4 ℃孵育过夜;加入二抗（IgG），室温孵育1 h。经化学发光底物显像，以β-actin为内参照，采用凝胶成像仪分析系统QuantityOne 1-D软件扫描条带的灰度值，计算目的蛋白与β-actin灰度值的比值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布时，2组间比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析;不符合正态分布时，采用秩和检验分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠外周血免疫性T细胞亚群分布比较  与模型组比较，低/高剂量实验组大鼠外周血CD3+、CD4+和NKT细胞比例均升高，且高剂量实验组高于低剂量实验组;而低/高剂量实验组CD8+细胞比例显著低于模型组，且高剂量实验组低于低剂量实验组（P<0.05）。见表1。

2.2 各组肿瘤体积、重量与抑瘤率比较 低/高剂量实验组肿瘤体积小于模型组，且高剂量实验组小于低剂量实验组;低/高剂量实验组肿瘤重量低于模型组，高剂量实验组低于低剂量实验组;同时高剂量实验组的抑瘤率高于低剂量实验组（P<0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠癌组织病理形态学表现 模型组癌组织中肿瘤细胞核大、深染，核分裂多;低/高剂量实验组可见癌组织内大片坏死，出现坏死灶，肿瘤细胞出现核固缩或碎裂现象，且高剂量实验组癌组织坏死情况较低剂量实验组明显。见图1。

2.4 各组大鼠癌组织P16、Ki67、P53、Survivin蛋白表达 模型组、低剂量实验组与高剂量实验组大鼠癌组织P16蛋白相对表达量分别为（0.14±0.07）、（0.31±0.12）、（0.95±0.05）;P53蛋白相对表达量分别为（0.17±0.06）、（0.43±0.11）、（0.86±0.13）;Ki67蛋白相对表达量分别为（0.84±0.12）、（0.37±0.14）、（0.15±0.07）;Survivin蛋白相对表达量分别为（0.78±0.11）、（0.34±0.12）、（0.13±0.06）。与模型组比较，低/高剂量实验组大鼠癌组织P16、P53蛋白相对表达量均显著升高，且高剂量实验组高于低剂量实验组;低/高剂量实验组大鼠癌组织Ki67、Survivin蛋白相对表达量低于模型组，且高剂量实验组低于低剂量实验组（P<0.05）。见图2。

3 讨论

宫颈癌是发病率高、致死率高的妇科恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌，虽然目前宫颈癌的诊断已基本完善，但其治疗仍是该病的难点[11]。目前外科手术及术后化疗是治疗宫颈癌的主要手段，但对于中晚期及复发转移的患者疗效较差，且易产生骨髓抑制、神经损伤等严重不良反应[12]。中医妇科学将宫颈癌列入“癥瘕”范畴，其最常见病因为痰湿结聚，常与血瘀相伴，终积为“癥”，故中医辨证以痰湿癥瘕型多见，治则为化痰软坚散结，活血祛瘀消癥;同时肿瘤患者的恶病质通常是由于气血阴阳不足，正气虚弱，邪气入侵引起。中医学认为，正气是防治疾病及抵御外在邪气入侵的基本[13-14]。中医药扶正法具有补气固表、增强机体抵抗力、益气温阳、滋阴养血等功能，而益气养阴方以茯苓、甘草、石斛、白术、黄芪、山药、麦冬、制龟甲、北沙参、白花蛇舌草等中药配伍入药而成，方中黄芪、太子参、白术、茯苓健脾益气、养阴清热，润肺生津;生地黄、黄精、天门冬、麦门冬、玄参、小蓟、墨旱莲、女贞子养阴补肾、凉血止血;白花蛇舌草、半枝莲、蒲公英清热解毒。该方从中医整体观点出发，辨证论治，注重标本兼顾，从攻邪而不伤正、扶正而不留邪出发，遣方用药切中肿瘤晚期转移之气阴两虚、瘀毒内结的病机，临床治疗肿瘤取得较好疗效[15]。本研究结果显示，与模型组比较，低/高剂量实验组大鼠外周血CD3+、CD4+和NKT细胞含量均升高，而CD8+细胞含量、肿瘤重量降低，同时肿瘤体积缩小，提示益气养阴方可有效抑制宫颈癌大鼠肿瘤的生长，同时改善免疫功能，发挥治疗宫颈癌的作用。研究发现，益气养阴方剂可抑制Lewis肺癌移植小鼠肿瘤的生长，发挥抗癌作用，且其作用机制可能与益气养阴方调控癌组织中Notch1信号通路及CD4+CD25+Treg细胞有关[16]。文献显示，白花蛇舌草与黄芪所含黄芪总黄酮均具有提高免疫能力的效果，能够改善肺癌患者的免疫功能[17]。

肿瘤的生长、迁袭与转移等是多种癌基因和抑癌基因的表达、调控及细胞凋亡参与的复杂过程，P16是一种新型抑癌基因，可阻止细胞由G1期进入S期，抑制细胞增殖，而在宫颈癌中存在P16的突变、缺失，导致宫颈癌细胞无限制增生，参与宫颈癌的发生发展[18];P53是细胞增生的主要负调控子，该基因的突变或缺失可使宫颈癌细胞异常增殖和惡性转化;Ki67是一种细胞增殖核抗原，其高表达是细胞增殖活跃的重要标记，可反映宫颈癌细胞的增殖活性，与宫颈癌的发生、发展、浸润、转移、复发及预后等有关[19]。Survivin是一种凋亡抑制因子，在细胞中呈周期依赖性表达，其异常表达可引起细胞凋亡抑制，与宫颈癌的发生、发展有关，可预示其不良预后[20]。目前关于宫颈癌与P16、Ki67、P53、Survivin表达的研究多集中于相关性分析及临床意义等方面，利用药物干预影响P16、Ki67、P53、Survivin表达方向的研究较少，本研究结果显示，与模型组比较，低/高剂量实验组大鼠癌组织P16、P53蛋白相对表达量均显著升高，而Ki67、Survivin蛋白相对表达量降低，提示益气养阴方可通过上调宫颈癌大鼠癌组织P16、P53蛋白表达，同时下调Ki67、Survivin蛋白表达，抑制宫颈癌细胞增殖，进而抑制肿瘤生长，但关于益气养阴方对宫颈癌的免疫调节与抗肿瘤作用是否还存在其他的作用机制还需进一步深入的研究。

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（2020-03-27收稿 责任编辑：芮莉莉）