毛蚶提取物辅助NP化疗的增效减毒作用

王作军，马玉奎，贾玉萍，高　清

(1.山东省临朐县人民医院，山东 临朐　262600；2.山东省药学科学院，济南　250033)



毛蚶提取物辅助NP化疗的增效减毒作用

王作军1，马玉奎2，贾玉萍2，高清1

(1.山东省临朐县人民医院，山东 临朐262600；2.山东省药学科学院，济南250033)

【摘要】目的研究毛蚶提取物和NP方案化疗药物合用后有无增效和减毒作用。方法采用人肺癌A549细胞株制备裸鼠移植瘤模型，通过检测抑瘤率、体重、摄食量、血液学和血液生化学等指标，全面评价毛蚶提取物和NP化疗方案合用后的增效减毒作用。结果毛蚶提取物(125、250、500 mg/kg, i.g)与NP化疗方案合用比单用NP化疗方案抑瘤率明显提高，明显抑制化疗引起的体重减轻、摄食量减少、减轻化疗对血液系统和肝肾功能的毒副作用。结论毛蚶提取物对NP方案化疗具有明显的增效减毒作用。

【关键词】毛蚶提取物；增效减毒；抑瘤率；化疗

毛蚶(arca subcrenata lischke)俗称毛蛤、麻蛤，属双壳软体动物，我国沿海地区资源丰富。毛蚶壳和肉均具有较高的营养与药用价值，《神农本草经》及历代本草中均有记载。毛蚶提取物为毛蚶肉经低温提取纯化加工制成，其主要的活性成份为毛蚶多糖和毛蚶多肽[1]。以往研究表明，毛蚶提取物具有抗氧化、提高免疫力、体外抗肿瘤等药理活性[2-4]。尽管有部分中药体外抗肿瘤活性较高，但药物的体内外活性会有较大差异，另外，单味中药一般情况下直接抗肿瘤作用较弱，临床上功效多体现在减轻临床症状、提高生存质量、防止复发转移、延长生存期、预防肿瘤、提高患者免疫力、增强放、化疗敏感性和减轻放、化疗不良反应等方面发挥作用[5]。故本文采用人肺癌A549裸鼠移植瘤模型初步考察了毛蚶提取物对NP化疗的增效减毒作用，为毛蚶提取物进一步研究和开发利用提供参考。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1动物及瘤株 裸小鼠，BALB/c nu，雄性，20～24 g，由北京大学医学部实验动物科学部【SCXK(京)2011-0012】，选取54只用于试验。动物饲养于山东省临朐县人民医院独立送风IVC-Ⅱ型隔离笼具中，实验动物使用许可证号【SYXK(鲁)2010 -0004】。室温20℃～25℃，湿度40%～70%，人肺癌A549细胞系，济南天长商贸有限公司提供。

1.1.2药品与试剂 毛蚶提取物(青岛海慈肿瘤医院提供，批号100805)，淡黄棕色粉末，味微咸、微腥，密封、置阴凉处保存；酒石酸长春瑞滨注射液(NVB，江苏豪森药业股份有限公司，批号：110301)；注射用顺铂(CDDP，齐鲁制药有限公司，批号：101003200)

1.1.3仪器Sysmex XT-2000IV型全自动血球计数仪(Sysmex Corporation制造)；BS300型生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司制造)。BC-J160S型二氧化碳细胞培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂制造)。BDS200型倒置生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司制造)。JY2001型电子天平(上海精密科学仪器有限公司制造)。电子数显卡尺(广陆数字测控股份有限公司制造)。

1.2方法

1.2.1毛蚶提取物制备

将鲜活的毛蚶软体组织洗净后捣碎进行匀浆，经低温提取、3000 r/min，离心15 min后去沉淀、生物澄清剂吸附后进行冷冻分离、冻干后得冻干粉，将冻干粉用硫酸铵分级沉淀、Superdex75凝胶过滤层析、合并分子量为3000×103以下的洗脱峰，得肽类化合物洗脱液，最后冻干洗脱液、再用灭菌注射用水溶解冻干粉、经SephadeG-25脱盐柱脱盐后所得提取液经冻干即得毛蚶提取物。提取物中含总蛋白质50%～60%，游离氨基酸3%，多糖2%，核糖核酸微量及少量的脂肪。

1.2.2裸鼠移植瘤模型建立及动物分组

将人肺癌A549细胞进行常规传代，增殖培养至所需细胞量后胰酶消化收集细胞，取细胞悬液置显微镜下计数调整细胞数。在无菌条件下，接种于裸小鼠右腋皮下，接种量1.0～2.0×107个细胞/0.1 mL/只。裸小鼠接种肿瘤细胞后，定期用游标卡尺分别测量瘤体积(V=3.14×长径×宽径×高[6])，测得瘤体积为100～300 mm3时，随机分为正常对照组、模型对照组、NP方案化疗对照组、毛蚶提取物组500、250、125 mg/kg三个剂量同时应用NP化疗方案组、毛蚶提取物组500、250、125 mg/kg三个剂量组，每组6只。

1.2.3动物给药

毛蚶提取物组给予不同剂量的药物，分组后每天灌胃给药1次，连续给药21 d；NP方案化疗组第8、16天各腹腔注射1次NVB，剂量为3.4 mg/kg，第10、12、14天各腹腔注射1次CDDP，剂量为6.7 mg/kg。毛蚶提取物和NP方案化疗合用组在NP方案化疗的同时给予不同剂量的毛蚶提取物；正常对照组和模型对照组灌胃给予等容积的蒸馏水和腹腔注射给予等容积的生理盐水。

1.2.4指标检测和结果评价[7]

试验中每3 d称量裸小鼠体重和摄食量，观察裸小鼠的一般状态。末次给药后2 h摘眼球采血，检测白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白 (HB)等血液学指标和丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TB)、白蛋白(ALB)等血液生化学指标。采血后将所有动物脱臼处死后解剖瘤块称瘤重，计算肿瘤抑制率。

肿瘤抑制率=(C-T)/C×100%，T为给药组平均瘤重，C为阴性对照组平均瘤重。得出抑瘤率后，以q值评定两药合用的疗效。

q值=E(AB)/[EA+(1-EA) ×EB]，E(AB)为两药合用的抑制率，EA、EB为两药单用的抑制率，q=0.85～1.15表示两药作用相加，q>1.15表示两药作用协同，q<0.85表示两药作用拮抗。

1.2.5统计学处理

2结果

2.1毛蚶提取物对NP方案化疗小鼠体重的影响

与模型对照组比较，NP方案化疗后小鼠体重逐渐减轻，而同时给予毛蚶提取物后，随着给药时间延长，裸小鼠体重逐渐恢复，给药21 d后体重稍低于模型对照组，而明显高于化疗组(表1)。

表1　毛蚶提取物对裸小鼠体重的影响

注：*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs模型组；#P﹤0.05, vs NP化疗组。

Note：*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs model group；#P﹤0.05, vs NP chemotherapy group.

2.2毛蚶提取物对NP方案化疗小鼠摄食量的影响

与模型对照组比较，NP方案化疗后小鼠摄食量明显减少，而同时给予毛蚶提取物后，随着给药时间延长，裸小鼠摄食量逐渐增多，其中NP方案化疗和毛蚶提取物250、500 mg/kg合用给药21 d后摄食量稍低于模型对照组，而明显高于化疗组(表2)。

2.3毛蚶提取物对NP方案化疗的增效作用

与模型对照组比较，NP方案化疗和毛蚶提取物合用后对肿瘤的抑制率明显高于单用NP方案化疗或者单用毛蚶提取物，其中NP方案化疗和毛蚶提取物250、500 mg/kg合用后q值大于0.85，具有明显的协同作用，说明毛蚶提取物在250 mg/kg剂量以上对NP方案化疗的抗肿瘤作用具有明显的增强作用(表3)。

表2　毛蚶提取物对裸小鼠摄食量的影响±s，n=6)

表3　毛蚶提取物对NP方案化疗的增效作用±s，n=6)

注：*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs模型组。

Note：*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs model group.

表4　毛蚶提取物对NP方案化疗血液学副作用的减毒作用±s，n=6)

注：**P﹤0.01, vs模型组；#P﹤0.05, vs NP化疗组。

Note：**P﹤0.01, vs model group；#P﹤0.05, vs NP chemotherapy group.

表5　毛蚶提取物对NP方案化疗血液生化学的减毒作用±s，n=6)

注：*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs模型组；#P﹤0.05, vs NP化疗组。

Note：*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs model group；#P﹤0.05, vs NP chemotherapy group.

2.4毛蚶提取物对NP方案化疗后血液学副作用的减毒作用

与模型对照组比较，NP方案化疗后小鼠的白细胞数量明显减少，而和毛蚶提取物合用后白细胞数量明显增多，与单纯NP方案化疗组比较均有显著性差异(P﹤0.05)，说明毛蚶提取物可明显抑制NP方案化疗引起的白细胞减少。各个剂量组对红细胞和血红蛋白无明显影响(表4)。

2.5毛蚶提取物对NP方案化疗后血液生化学副作用的减毒作用

与模型对照组比较，NP方案化疗后小鼠血清中ALT、AST和BUN明显升高，说明NP化疗可以引起小鼠肝肾功能的损伤，而和毛蚶提取物250、500 mg/kg合用后以上指标升高幅度减少，与单纯NP方案化疗组比较均有显著性差异(P﹤0.05)，说明毛蚶提取物对NP方案化疗引起的肝肾功能的损伤有明显保护作用(表5)。

3讨论

肺癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中占首位,严重危害人类的生命与健康。非小细胞肺癌属于肺癌的一种，非小细胞肺癌约占肺癌总敉的80%～85%[8]。目前临床上非小细胞肺癌常采用化疗的方式进行治疗。但是饱经癌症折磨的患者应用化疗药物后，还要承受很大的毒副作用，有相当一部分患者特别体质比较差的患者根本无法承受。所以如何提高化疗药物的治疗效果，降低不良反应是临床上亟待解决的问题，而中医药在这方面发挥了良好的作用。临床上常会采用中药作为辅助手段通过扶正培本和调节机体免疫功能等在降低毒副作用的同时增强治疗效果，可以有效地改善患者的不良症状，提高患者的生活质量，延长生存期。

以往对中药增效减毒作用的试验研究多集中在中药与单个化疗药物合用后观察其疗效，而目前临床上多采用多种化疗药物联合应用，故研究对单个化疗药物的增效和减毒无法完全模拟临床实际情况。因此在动物模型研究中采用临床标准治疗方案，完全模拟临床治疗情况，才能更有的放矢地评价中药的功效。在非小细胞肺癌的国际治疗指南中，NP是推荐的标准治疗方案[9]，故本文采用A549裸鼠移植瘤模型为实验对象，研究毛蚶提取物对NP方案化疗的增效和减毒作用。本实验研究证明，单纯NP化疗后，裸小鼠出现了体重减轻、摄食量减少、白细胞降低、肝肾功能损伤等毒副反应，与临床上体现的副作用基本一致，而同时应用毛蚶提取物后，随着给药时间的延长，以上毒副反应逐渐减轻，体重和摄食量等均逐渐恢复，白细胞数量逐渐增多，给药21 d时与模型组基本一致，明显高于NP化疗组，而血清中AST、ALT和BUN含量明显低于NP化疗组。同时，毛蚶提取物与NP方案化疗合用后对A549裸鼠移植瘤的抑制效果明显增强。以上研究结果充分证明毛蚶提取物具有明显的增效减毒作用，提示其具有进一步研究和开发利用的价值。

参考文献：

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[3]黄演君，宋丽艳，于荣敏. 毛蚶多肽提取物的体外免疫活性[J]. 中国生化物杂志, 2011, 32(4): 273-276.

[4]Song L, Reu S,Yu R,etal. Purification, characterization and in vitro anti-tumor activity of proteins from Arca Sbcrenata Lischke[J]. Mar Drugs, 2008, 6(3): 418-430.

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[8]Kurup A, Hanna NH. Treatment of small cell lung cancer[J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2004, 52(2): 117-126.

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〔修回日期〕2015-03-31

研究报告

Synergism and attenuation effects of Scapharca

Subcrenata Extraction on NP chemotherapy

WANG Zuo-jun1，MA Yu-kui2，JIA Yu-ping2，GAO Qing1

(1. People’s Hospital of Linqu County，Shandong Linqu 262600，China；2. Shandong Pharmaceutical Academy，Jinan 250033，China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the synergism and attenuation effects of Scapharca Subcrenata Extraction on NP chemotherapy in model mice. Methods The models of nude mice were induced with A549 cell line xenograft. The tumor inhibiting rates, body weight, food intake, hematology and blood biochemistry index were determined to evaluate the synergism and attenuation effects of Scapharca Subcrenata Extraction (125、250、500 mg/kg, i.g) on NP chemotherapy. ResultsCompared with NP chemotherapy group, the tumor inhibiting rates, body weight, food intake, white blood cell number were increased and glutamate pyruvate transaminase, glutamic oxalacetic transaminase and urea nitrogen were decreased markedly in NP chemotherapy plus Scapharca Subcrenata Extraction groups. Conclusion Scapharca Subcrenata Extraction has a remarkable synergism and attenuation effects on NP chemotherapy.

【Key words】Scapharca Subcrenata extraction；Synergism and attenuation；Tumor inhibition rate；Chemotherapy

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.009

【中图分类号】R332

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856(2015) 05-0037-05

[通讯作者]马玉奎 (1975-)，男， 副主任药师，博士，研究方向：新药药理毒理评价。 E-mail： yukuima@sina.com。

[作者简介]王作军(1969-)，男，主管药师，本科， 研究方向： 药物不良反应检测。