补肺益肾方联合舒肺贴对COPD大鼠肺脏Jagged1/notch1通路的影响*

李 亚，田燕歌，董玉琼，李琳琳，王明航，毛 静，王丽丽，罗 珊

(1.河南中医学院第一附属医院中药呼吸药理实验室，河南 郑州450000； 2.河南中医学院老年医学研究所，河南 郑州450046； 3.河南中医学院第一附属医院呼吸病研究室，河南 郑州450000)

·实验研究·

补肺益肾方联合舒肺贴对COPD大鼠肺脏Jagged1/notch1通路的影响*

李 亚1，田燕歌2，董玉琼3，李琳琳2，王明航3，毛 静3，王丽丽3，罗 珊3

(1.河南中医学院第一附属医院中药呼吸药理实验室，河南 郑州450000； 2.河南中医学院老年医学研究所，河南 郑州450046； 3.河南中医学院第一附属医院呼吸病研究室，河南 郑州450000)

目的：评价补肺益肾方联合舒肺贴对慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)稳定期大鼠肺脏Jagged1/notch1通路的影响。方法：大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、舒肺贴组、补肺益肾组、补肺益肾联合舒肺贴组和氨茶碱组。采用熏烟和细菌感染制备COPD模型。分别于第0,8,20周观察肺功能，第20周检测肺jagged1、notch1 mRNA和蛋白表达。结果：模型对照组大鼠肺潮气量(tidal volume，VT)、呼气峰流速(peak expiratory flow，PEF)及肺脏Jagged1、Notch1基因及蛋白表达降低(P<0.01)。各治疗组VT、PEF、Jagged1、Notch1基因和蛋白较模型对照组升高，以联合组升高明显(P<0.05)。结论：补肺益肾联合舒肺贴可调控肺组织Jagged1、Notch1基因及蛋白表达，参与细胞分化过程，作用优于单独使用补肺益肾方或舒肺贴。

慢性阻塞性肺疾病/中医药疗法；补肺益肾方；舒肺贴；Jagged1/notch1

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种严重危害公众健康的重大疾病，目前已成为我国第三大致死原因，仅次于中风和缺血性心脏病[1]。COPD以持续存在的气流受限为特征，表现为肺功能的进行性下降[2]。近年来，中医药(包括内、外治法)在COPD稳定期的治疗作用逐渐受到重视。前期研究表明：补肺益肾方(专利号：ZL.201110117578.1)、舒肺贴(专利号：ZL.20081004933 2.3)，及其联合可改善COPD患者临床症状，减少急性加重次数等[3-6]，但作用机制尚不明确。Notch通路在肺和气道上皮细胞、T淋巴细胞分化和细胞分泌中起重要作用，可抑制杯状细胞化生和黏液分泌，减缓COPD发展进程[7]。本研究以COPD稳定期大鼠模型为研究对象，观察肺组织Jagged1/notch1通路基因和蛋白的变化，探讨补肺益肾方联合舒肺贴治疗COPD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级SD大鼠72只，雌雄各半，体质量(200±20)g，由河南省实验动物中心提供，质量合格证号：SCXK(豫)2010-0002。

1.2 菌 株

肺炎克雷伯杆菌，菌株号46114，中国生物制品检验鉴定所提供，使用前配成6×108菌落形成单位/mL的混悬液。

1.3 药品与试剂

补肺益肾方由人参、黄芪、枸杞、五味子、淫羊藿等组成，舒肺贴由白芥子、延胡索、干姜等组成，均由河南中医学院第一附属医院国家中医药管理局中药制剂三级实验室提供；氨茶碱片，0.1 g/片，山东新华制药股份有限公司产品，批号H37020630。红旗渠牌过滤嘴香烟，烤烟型，焦油量10 mg，烟气烟碱量1.0 mg，烟气一氧化碳量11 mg，河南中烟工业有限责任公司产品。Jagged1(批号SC-8303)、Notch1(批号SC-9170)、β-actin(批号SC-130657)，HRP-兔抗IgG(批号SC-292373)由美国Santa Cruz公司提供。TRIzol REAGENT(批号15596-026)、SuperScipt Ⅲ First-Stand Synthesis SuperMix for qRT-PCR逆转录试剂盒(批号11752-050)、SYBR Green试剂盒(批号C11744)，由美国Invitrogen公司提供。Jagged1、Notch1 mRNA和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。Jagged1(产物长度170bp)：5′-CAG TGG CTT GGG TCT GTT GCT T-3′(上游)，5′-TGT GTT GGC TCC GTG TTT CTC G -3′(下游)。Notch1(产物长度128bp)：5′-CTT CGT GCT CCT GTT CTT TGT G -3′(上游)，5′-GTT CTC TCC GCT TCT TCT TGC T -3′(下游)。GAPDH(产物长度252bp)：5′-TTT GAG GGT GCA GCG AAC TT-3′(上游), 5′-ACA GCA ACA GGG TGG TGG AC-3′(下游)。

1.4 动物分组与模型的建立

采用随机数字表法将72只大鼠分为空白对照组、模型对照组、补肺益肾组、舒肺贴组、补肺益肾联合舒肺贴组(简称联合组)、氨茶碱组，每组12只。采用香烟熏吸联合反复感染肺炎克雷伯杆菌法建立COPD稳定期大鼠模型[8]。香烟熏吸：第1～2周，8支/次，2次/d；第3～12周，15支/次，3次/ d；30 min/次，每次熏吸间隔 3 h，共12周。第1～8周，造模大鼠经鼻腔滴入肺炎克雷伯杆菌混悬液0.1 mL，5 d 1次。

1.5 给药与处理

选择大椎、双侧肺俞、双侧肾俞共5个穴位。轻度麻醉大鼠，穴位部位采用Na2S(80 g/L)脱毛，面积约1.5 cm×1.5 cm。将0.1 g舒肺贴药物贴敷于穴位处，以医用胶带固定。第9～20周，每周一、四进行穴位贴敷，4～6 h/次。贴敷以发红或起泡但不溃烂为度。若有皮肤损伤，碘酒消毒，用纱布固定以防感染。肺俞、肾俞若一侧穴位破损，则贴敷健侧；若两侧皆破损且至下次贴敷时仍未结痂或愈合，暂停贴敷1次；若间隔2次或2次以上仍无法贴敷者，被淘汰。自第9周第1天起，空白对照组、模型对照组以 2 mL生理盐水灌胃联合模拟穴位贴敷(轻度麻醉,脱毛,用空白胶带贴于大椎、双侧肺俞、双侧肾俞)，补肺益肾组以补肺益肾方[4.44 g/(kg·d)，下同]灌胃联合模拟穴位贴敷，舒肺贴组用生理盐水2 mL灌胃联合舒肺贴穴位贴敷，联合组以补肺益肾方灌胃联合舒肺贴穴位贴敷，氨茶碱组以氨茶碱[2.3 ng/(g·d)]灌胃联合模拟穴位贴敷，至第20周末结束，每日灌胃2次。每周称量大鼠体质量以调整给药剂量。药物剂量采用等效剂量换算公式计算。公式为D大鼠=D人×(HI大鼠/HI人) × (W人/W大鼠)2/3。D为剂量，HI为体型系数，W为体质量。

1.6 检测指标

1.6.1 潮气量、呼气峰流速

分别于第0，8，20周结束时测定肺功能，观测肺潮气量(tidal volume，VT)、呼气峰流速(peak expiratory flow，PEF)。

1.6.2 Jagged1和notch1 mRNA表达

采用实时荧光定量PCR检测。取肺组织50 mg，用TRIzol法进行总RNA提取，使用SuperScipt Ⅲ First-Stand Synthesis SuperMix for qRT-PCR逆转录试剂盒反转录为cDNA，再进行PCR反应，反应条件为：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min； 95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40cycles；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s。

1.6.3 Jagged1和notch1蛋白表达

采用免疫印迹法(Western-blotting)测定。取100～200 mg肺组织提取蛋白，测定蛋白浓度，用湿转转膜仪转膜，用质量分数为 50 g/L的牛血清白蛋白封闭，一抗4 ℃孵育过夜，二抗30 ℃孵育1 h，洗涤，继之于暗室内用ECL发光液进行荧光检测，并将条带曝于X光片上，用凝胶图像分析系统进行胶片扫描并分析。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠VT、PEF对比

第8周结束时，COPD大鼠VT、PEF均较空白对照组降低，差别有统计学意义(P<0.01)。第20周结束时，模型对照组VT、PEF变化较正常对照组降低，差别有统计学意义(P<0.01)，补肺益肾组、联合组及氨茶碱组VT 较模型组升高(P<0.05)，补肺益肾组及联合组PEF较模型组升高(P<0.01，P<0.05)。见表1。

组 别动物数VT/mL0周8周20周PEF/(mL·s-1)0周8周20周空白对照组121.54±0.061.68±0.07**1.71±0.04**15.89±1.1116.57±0.14**16.78±0.39**模型对照组101.51±0.051.45±0.051.42±0.1315.26±1.0411.85±0.1411.74±0.71舒肺贴组101.51±0.041.46±0.111.54±0.1116.12±0.8711.96±0.2313.23±0.37补肺益肾组111.51±0.091.46±0.071.57±0.07*16.22±2.1512.01±0.1813.53±0.67*联合组121.54±0.081.48±0.081.61±0.05*16.39±1.4611.88±0.3014.19±0.36**氨茶碱组101.52±0.081.50±0.061.55±0.08*15.87±1.2911.79±0.1312.97±0.75

注：与模型对照组对比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各组大鼠肺组织Jagged1mRNA和Notch1mRNA表达对比

模型对照组Jagged1mRNA、Notch1mRNA较空白对照组明显降低，差别有统计学意义(P<0.01)，舒肺贴组、补肺益肾组、联合组及氨茶碱组均较模型对照组明显升高(P<0.01)；与氨茶碱组对比，补肺益肾组、联合组Jagged1mRNA、Notch1mRNA均增高(P<0.05，P<0.01)；补肺益肾组、联合组Jagged-1mRNA、Notch1mRNA较舒肺贴组升高(P<0.05，P<0.01)；联合组较补肺益肾组升高(P<0.05)。见表2。

组 别动物数Jagged1mRNANotch1mRNA空白对照组61.000±0.000**1.000±0.000**模型对照组60.442±0.0470.463±0.015舒肺贴组61.436±0.063**1.561±0.079**补肺益肾组61.633±0.052**△1.740±0.041**△△联合组61.865±0.034**△△#1.885±0.017**△△#氨茶碱组61.398±0.121**#▲▲1.490±0.059**##▲▲

注：与模型对照组对比，*P<0.05，**P<0.01；与补肺益肾组对比，#P<0.05，##P<0.01；与舒肺贴组对比，△P<0.05，△△P<0.01；与联合组对比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

2.3 各组大鼠肺组织Jagged1和Notch1蛋白表达对比

模型对照组Jagged1、Notch1蛋白表达较空白对照组明显降低，差别有统计学意义(P<0.01)；舒肺贴组、补肺益肾组、联合组Jagged1、Notch1蛋白表达均较模型对照组升高(P<0.01,P<0.05)；氨茶碱组Notch1蛋白表达较模型组升高(P<0.05)。见表3。

组 别动物数Jagged1/β-ActinNotch1/β-Actin空白对照组60.714±0.052**0.733±0.032**模型对照组60.504±0.0380.599±0.013舒肺贴组60.644±0.056*0.710±0.008*补肺益肾组60.663±0.028*0.747±0.002**联合组60.677±0.034*0.757±0.015**氨茶碱组60.611±0.0330.697±0.053*

注：与模型对照组对比，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨 论

慢性阻塞性肺疾病属中医学“肺胀”“喘证”等范畴。李建生教授认为“正虚积损”为COPD的主要病机，正虚多为气虚、阳虚，或阴阳虚损，表现于肺、脾、肾，而以肺为初始并以肾为基，肺肾气虚兼见痰瘀互结为其主要证候，治疗当以补肺益肾佐以化痰祛瘀[9-10]。补肺益肾方由人参、黄芪、山茱萸、枸杞子等组成，具有补肺益肾、化痰祛瘀、止咳平喘等功效。该治疗方法的穴位贴敷属冬病夏治，是针对COPD特点，在夏季人体阳气最旺盛之时，将辛温药物贴敷于相应腧穴，借助外界温热之气，以达到疏通经络、调整气血、祛除体内沉积之寒气，减少冬天反复发作的目的。选用白芥子、细辛等辛温发散之品，贴敷于肺俞、肾俞、大椎等穴位，可开宣肺气、透达经络。补肺益肾方、舒肺贴及其联合治疗COPD稳定期有良好的临床疗效[3-6]。本组资料显示：舒肺贴、补肺益肾方及其联合，以及氨茶碱治疗可改善COPD大鼠肺功能，以补肺益肾方联合舒肺贴改善尤为显著。

Notch通路包括4个成员(Notch1～4)，通过与相邻细胞表面配体(Jaggedl，2和Delta l，3，4)相互作用传递Notch信号，参与多种细胞、组织分化，与肺和气道上皮细胞成熟、分化密切相关。Notch1可直接参与调节肺泡Ⅰ型和Ⅱ型细胞分化，Notch1的活化决定了细胞向分泌型或非分泌型细胞分化[11-12]。研究[13]显示：吸烟者和COPD患者气道上皮Jagged1、notch2基因表达明显下调。

此外，Notch信号通路在T淋巴细胞分化、增殖、变异中也具有重要作用，参与机体的免疫调节。Notch受体的活化可促进淋巴前体细胞向T淋巴细胞方向分化，Notch通路可调控T淋巴细胞活性，其活化可阻断促凋亡核受体蛋白Nur77的活性，从而抑制T淋巴细胞凋亡[14]。Notch信号转导还可调节CD4+T淋巴细胞的聚集及其病理功能[15]。本研究资料显示，COPD大鼠肺组织Jagged1、Notch1基因及蛋白表达明显降低，补肺益肾方联合舒肺贴治疗可明显改善Jagged1、Notch1基因表达，优于单纯补肺益肾方、舒肺贴和氨茶碱，且补肺益肾方改善较舒肺贴和氨茶碱显著，而在Jagged1、Notch1蛋白表达方面，虽有类似的趋势，但各组差别无统计学意义。综上所述，补肺益肾方联合舒肺贴可能通过Jagged1/notch1通路调控肺上皮细胞和/或T淋巴细胞的分化、增殖等而发挥相关作用，且较单纯补肺益肾方或舒肺贴显著，但该通路通过何种细胞发挥作用尚不十分清楚，需要进行细胞水平方面的深入研究。

[1]Yang G, Wang Y, Zeng Y, et al. Rapid health transition in China, 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010[J]. Lancet, 2013, 381(9882):1987-2015.

[2]Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management and prevention of chronic obstructive pulmonary disease (updated 2015)[EB/OL]. (2015-02-18)[2015-04-02]http://www.goldcopd.org/uploads/users/files/GOLD_Report_2015_Feb18.pdf.

[3]Li SY, Li JS, Wang MH,et al.Effects of comprehensive therapy based on traditional Chinese medicine patterns in stable chronic obstructive pulmonary disease: a four-center, open-label, randomized, controlled study [J].BMC Complement Altern Med, 2012(12): 197.

[4]李素云,李建生, 余学庆, 等. 舒肺贴治疗慢性阻塞性肺疾病疗效观察[J]. 陕西中医, 2009, 30(4):391-392.

[5]张盼奎, 余学庆,李建生, 等.舒肺贴治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期47例[J].中医研究, 2013, 26(2):50-52.

[6]Li JS, Li SY, Yu XQ, et al.Bu-Fei Yi-Shen granule combined with acupoint sticking therapy in patients with stable chronic obstructive pulmonary disease: A randomized, double-blind, double-dummy,active-controlled,4-center study[J]. J Ethnopharmacol, 2012, 141(2):584-591.

[7]Tsao PN, Wei SC, Wu MF, et al.Notch signaling prevents mucous metaplasia in mouse conducting airways during postnatal development[J].Development, 2011, 138(16):3533-3543.

[8]Li Y, Li SY, Li JS, et al.A rat model for stable chronic obstructive pulmonary disease induced by cigarette smoke inhalation and repetitive bacterial infection[J].Biol Pharm Bull, 2012, 35(10): 1752-1760.

[9]李建生.正虚积损为慢性阻塞性肺疾病的主要病机[J]. 中华中医药杂志, 2011, 26(8):1710-1713.

[10]王至婉, 李建生, 余学庆, 等. 基于文献的COPD稳定期证候要素分布规律的研究[J]. 辽宁中医杂志, 2008, 35(4):513-514.

[11]张谦慎, 常立文, 刘汉楚, 等.Notch信号与大鼠肺发育的关系研究[J].华中科技大学学报：医学版, 2004, 33(3):339-342.

[12]Guseh JS, Bores SA, Stanger BZ, et al.Notch signaling promotes airway mucous metaplasia and inhibits alveolar development[J].Development,2009,136(10):1751-1759.

[13]Tilley AE, Harvey BG, Heguy A, et al.Down-regulation of the Notch Pathway in Human Airway Epithelium in Association with Smoking and Chronic Obstructive Pulmonary Disease[J].Am J Respir Crit Care Med, 2009, 179(6):457-466.

[14]Tan JB,Visan I,Yuan JS,et al.Requirement for Notch1 signals at sequential early stages of intrathymic T-cell development [J].Nature Immunol, 2005, 6(7):671-679.

[15]Sandy AR, Stoolman J, Malott K, et al.Notch signaling regulates T cell accumulation and function in the central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Immunol, 2013, 191(4):1606-1613.

(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)11-0059-05

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.11.30

李亚(1980-)，男(汉族)，河南夏邑人，河南中医学院第一附属医院中药药理(呼吸)实验室讲师，博士，2013年赴美国密歇根州立大学研修，主要从事中医药防治呼吸系统疾病研究。

王明航，副教授，博士，wmh107hn@163.com

国家自然科学基金青年项目(81302921)；国家中医药管理局国家中医临床研究基地业务建设科研专项(JDZX2012030)；河南省教育厅科学技术研究重点项目(13A360594)

2015-08-17；

2015-09-25