TNBS诱导炎症性肠病大鼠结肠神经元tau蛋白磷酸化以及COX-2表达的变化*

赵廷坤，王志东，刘风娇，曲梅花，高志芹

(潍坊医学院应用药理学山东省高校重点实验室，潍坊医学院药理学教研室，山东潍坊261053)



TNBS诱导炎症性肠病大鼠结肠神经元tau蛋白磷酸化以及COX-2表达的变化*

赵廷坤，王志东，刘风娇，曲梅花△，高志芹△

(潍坊医学院应用药理学山东省高校重点实验室，潍坊医学院药理学教研室，山东潍坊261053)

［摘要］目的:探讨三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)诱导炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)模型大鼠结肠神经元tau蛋白磷酸化和环氧合酶2(COX-2)表达的变化。方法: 30只健康雄性成年Wistar大鼠随机分为对照组、IBD模型组和TNBS组，每组10只，IBD模型组以TNBS乙醇连续灌肠14 d造模，对照组和TNBS组分别以等量生理盐水和TNBS灌肠;观察大鼠的一般情况和结肠病理组织学改变，用anti-Hu作为神经元标志以免疫荧光法检测结肠黏膜下神经元的数量变化，免疫荧光双染色检测结肠黏膜下神经元COX-2和磷酸化tau231、tau262的表达变化。结果:与对照组比较，IBD模型组大鼠结肠黏膜下神经元数量明显减少(P＜0.05)，神经元tau蛋白磷酸化程度明显升高(P＜0.05)，而TNBS组大鼠神经元数量与对照组相比无显著差别;对照组和TNBS组大鼠结肠黏膜下神经元几乎不表达COX-2，IBD模型组大鼠结肠神经细胞胞核和胞浆中均有COX-2的表达，与对照组和TNBS组相比有显著差异(P＜0.05)。结论: TNBS乙醇诱导IBD模型大鼠结肠黏膜下神经元减少，可能与tau蛋白高度磷酸化及COX-2表达有关。

［关键词］炎症性肠病; Tau蛋白;环氧合酶2;肠神经系统

［修回日期］2015-03-19

Changes in phosphorylation of tau protein and COX-2 expression in colon submucosal neurons of IBD model rats induced by TNBS

ZHAO Ting-kun，WANG Zhi-dong，LIU Feng-jiao，QU Mei-hua，GAO Zhi-qin
(Key Lab of Applied Pharmacology in Universities of Shandong，Department of Pharmacology，Weifang Medical University，Weifang 261053，China.E-mail: qumeihua@ hotmail.com; zhiqingao@ wfmc.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the change of phosphorylation of tau protein and expression of cyclooxygenase 2 (COX-2) in colon submucosal neurons of enteric nerve system in inflammatory bowel disease (IBD) rats induced by trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).METHODS: Male rats (n=30) were randomly assigned to 3 groups (n=10 each) : control group，IBD group and TNBS group.The IBD rats were induced by TNBS+ ethanol enema for 14 d.The control and TNBS rats were given an equal volume of saline and TNBS，respectively.The general situation and the histopathologic change of the rat colon were observed.Immunofluorescence was used to check the change of phosphalated tau protein and COX-2 expression in the submucosal neurons of the colon.The expression of COX-2 and phosphorylated tau231 and tau262 in the rat colon submucosal neurons was observed by double immunofluorescence staining.RESULTS: Compared with control group，the number of neurons in the colon of IBD rats decreased obviously and the expression of phospholated tau231 and tau262 was significantly increased.The number of neurons in the colon of TNBS rats showed no significant difference compared with control rats.The rat neurons in control group and TNBS group did not express COX-2.COX-2 expression was observed in the nucleus and cytoplasm of colonic neurons in IBD rats，which showed significantly different from control and TNBS rats.CONCLUSION: The decreased neurons in the enteric nerve system of IBD rats might be associated with the phosphorylation of tau protein and the expression of inducible COX-2.

［KEY WORDS］Inflammatory bowel diseases; Tau protein; Cyclooxygenase 2; Enteric nervous system

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，可有腹泻、腹痛、便血、体重减轻等表现，其病因和发病机制尚未完全明确［1］。研究表明IBD中肠神经系统结构和功能表现异常，IBD患者肠黏膜中肠神经元的数目明显减少［2］，在三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)结肠炎大鼠模型也有肠道神经元数目减少，炎性损害往往出现在黏膜下层，因此黏膜下神经元数目减少更为明显［3］，但是IBD引起的肠道神经元数目减少的机制目前还不清楚。本研究通过制备TNBS乙醇诱导IBD大鼠结肠黏膜下神经丛铺片标本，采用免疫荧光法，分别对肠神经元总数、磷酸化tau231和tau262免疫反应阳性神经元、环氧合酶2 (cyclooxygenase 2，COX-2)进行定量分析，评估IBS大鼠结肠黏膜下神经元变化与COX-2、磷酸化tau之间的关系。

材料和方法

1动物

SPF级Wistar大鼠，6～8周龄，体重250～350 g，雄性，由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物室提供，许可证号为SCXK鲁20 080 002。

2主要试剂

TNBS购自Sigma;大鼠anti-Hu抗体购自Molecular Probes;兔anti-tau(pT231)和anti-tau(pS262)抗体购自Life Technologies;兔胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase，ChAT)抗体、兔COX-2抗体、羊抗兔IgG-FITCⅡ抗、羊抗大鼠IgG-FITCⅡ抗和羊抗兔IgG-Cy3Ⅱ抗均购自武汉博士德生物工程有限公司;山羊血清购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3主要方法

3.1 TNBS乙醇诱导IBD大鼠模型的制备［4］取Wistar大鼠，术前禁食24 h，自由饮水，乙醚轻微麻醉后，用硬膜外麻醉导管经肛门轻缓地插入8 cm，深达结肠，然后快速注射50 mg/kg的TNBS乙醇溶液(5% TNBS溶液与等体积无水乙醇混合)。每天1次，连续14 d;对照组和TNBS组分别以等量生理盐水和TNBS灌肠。

3.2大鼠结肠黏膜下神经丛(submucosal plexus，SMP)铺片标本的制备本实验方法参见文献［5］，铺片标本进行免疫荧光检测。

3.3结肠黏膜下神经元检测SMP标本，室温下DMSO浸洗，PBS清洗，0.1%硼氰化钠溶液浸洗，PBS再次清洗后将标本置于10%山羊血清中室温孵育2 h，加入anti-HuⅠ抗4℃过夜，PBS漂洗后加羊抗大鼠IgG-FITCⅡ抗，室温避光2 h，PBS漂洗后将标本展开平铺于载玻片上，甘油封片。

3.4Anti-Hu抗体与anti-tau (pT231)和anti-tau (pS262)抗体免疫荧光双染色检测大鼠anti-Hu染色同上，然后分别加兔anti-tau(pT231)和anti-tau (pS262)抗体4℃过夜; PBS漂洗后加羊抗兔IgGCy3Ⅱ抗，室温避光2 h。PBS漂洗后将标本完全展开平铺于载玻片上，甘油封片，加盖玻片，荧光显微镜检查。

3.5 Anti-Hu抗体与COX-2抗体免疫荧光双染色检测大鼠anti-Hu染色同上，然后滴加兔COX-2Ⅰ抗4℃过夜。PBS漂洗后加羊抗兔IgG-Cy3Ⅱ抗，室温避光2 h，PBS漂洗后将标本完全展开平铺于载玻片上，甘油封片，加盖玻片。

3.6 ChAT抗体与COX-2抗体免疫荧光双染色检测

制作好的的标本置于室温PBS中清洗，将标本置于10%山羊血清中室温下孵育2 h，加入兔ChATⅠ抗4℃过夜，PBS漂洗后加羊抗兔IgG-FITCⅡ抗，室温避光2 h，PBS漂洗后滴加兔COX-2Ⅰ抗4℃过夜。PBS漂洗后加羊抗兔IgG-Cy3Ⅱ抗，室温避光2 h，PBS漂洗后将标本完全展开平铺于载玻片上，甘油封片，加盖玻片。

3.7铺片标本神经元计数方法每只大鼠取3张铺片标本，置于荧光显微镜下，每张标本随机计数8个不重合低倍视野，分别计数anti-Hu染色阳性神经元总数，双染第二种特异抗体阳性神经元总数。

4统计学处理

用SPSS 13.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1一般情况和病理组织学改变

对照组和TNBS组大鼠大便、饮食、体重、毛发光泽度、活动度和精神状态良好。IBD模型组大鼠在造模后均出现腹泻和稀便，并伴食欲和体重下降，毛发干枯，懒动，部分出现黏液脓血便。病理组织学，IBD模型组大鼠可见结肠黏膜充血、水肿、糜烂，并伴溃疡形成(结果未显示)。

2 TNBS乙醇诱导IBD大鼠结肠黏膜下神经元减少

Anti-Hu免疫荧光染色结果显示，对照组大鼠结肠黏膜下神经元数为(12.3±3.3) mm－1，IBD模型组为(8.7±2.6) mm－1，TNBS组为(11.9±2.8) mm－1，对照组、TNBS组与IBD模型组之间有显著差异(P＜0.05)，TNBS组与对照组之间无显著差异，见图1。

Figure 1.The expression of Hu protein and the neuron number in rat colonic submucosal plexus (immunofluorescence staining).Scale bars=50 μm.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs control and TNBS.图1大鼠结肠黏膜下神经元Hu蛋白免疫组化染色结果

3 IBD大鼠结肠黏膜下神经元tau蛋白磷酸化水平明显升高

免疫荧光双标法比较正常大鼠和IBD模型大鼠结肠黏膜下神经元tau蛋白磷酸化程度与肠神经细胞数目的关系，实验结果显示，磷酸化tau蛋白tau231和tau262在正常和IBD大鼠结肠黏膜下神经元均有表达，并且IBD大鼠结肠黏膜下神经元磷酸化tau蛋白tau231和tau262的荧光强度明显高于正常对照组，见图2、3。

4 IBD大鼠结肠黏膜下神经细胞COX-2表达明显升高

免疫荧光染色显示，IBD大鼠结肠黏膜下神经元的胞核和胞浆均有诱导性COX-2的表达，(65.2± 4.8) %的anti-Hu免疫荧光染色阳性神经元表达COX-2，(66.7±4.6) %的ChAT免疫荧光染色阳性神经元表达COX-2，而对照组(结果未显示)和TNBS组大鼠结肠黏膜下神经元几乎不表达COX-2，这2组与IBD大鼠之间有显著差异(P＜0.05)，见图4。

Figure 2.Colocalization of phospholated tau (detected by antibody pT231) and Hu protein in the colon submucosal plexuses in rats.Scale bars=50 μm.图2大鼠结肠黏膜下神经元anti-Hu抗体与anti-tau(pT231)抗体免疫双染色结果

Figure 3.Colocalization of phospholated tau (detected by antibody pS262) and Hu protein in the colon submucosal plexuses in rats.Scale bars=50 μm.图3大鼠结肠黏膜下神经元anti-Hu抗体与anti-tau(pS262)抗体免疫双染色结果

Figure 4.The expression of COX-2 in rat colonic submucosal plexuses.Scale bars=20 μm.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs control and TNBS.图4大鼠结肠黏膜下神经元COX-2蛋白免疫荧光染色结果

讨论

乙醇破坏大鼠的肠黏膜屏障，TNBS作为半抗原与肠道内蛋白结合成为全抗原，诱发机体产生免疫反应，引发结肠的炎症［4］。本研究发现，TNBS单独灌肠并不能诱导大鼠结肠的炎症，而TNBS乙醇诱导的IBD模型大鼠有结肠炎的病理特征，同时结肠黏膜下神经元减少，神经元tau蛋白磷酸化程度升高，并且胞核和胞浆均有诱导性COX-2的表达，而正常大鼠结肠黏膜下神经细胞不表达COX-2。

核蛋白Hu是一组神经元特异性抗原，它可标记肠神经系统的神经细胞，抗Hu抗体可使肠神经细胞的胞体和胞核染色，而神经纤维包括触突、树突和细突均不被染色，故Hu蛋白免疫荧光染色可用于神经元计数［6］。本研究发现，TNBS乙醇诱导的IBD模型大鼠结肠黏膜下神经元减少，这与Sanovic等［3］的报道相一致。

COX-2属诱导型环氧酶，在各种刺激因子及炎症细胞因子等的作用下诱导表达，它使组织过量生成PGs，继而PGs介导各种炎症反应。Hendel等［7］研究发现活动性IBD病人结肠中有COX-2 mRNA的表达，且表达量随炎症程度的增加而增加; Roberts等［8］报道在IBD病人结肠上皮细胞和肌间神经丛COX-2表达均有增加。本研究发现IBD模型大鼠结肠黏膜下神经元COX-2表达明显升高，对照组大鼠几乎不表达; ChAT是乙酰胆碱合成的关键酶，可以特异性标记胆碱能神经元，本研究发现IBD模型大鼠结肠黏膜下胆碱能神经元COX-2表达也明显升高，以上结果表明COX-2与TNBS诱导的IBD大鼠结肠黏膜下神经元减少有关。

Tau蛋白是一种微管相关蛋白，主要分布在中枢和外周神经的神经元轴突内［9］，在中枢神经系统，tau蛋白异常高度磷酸化会导致神经纤维缠结的形成及神经元变性［10］。本研究发现，TNBS乙醇诱导的IBD模型大鼠结肠黏膜下神经元tau蛋白Thr231和Ser262磷酸化程度升高，表明tau蛋白高度磷酸化与IBD大鼠结肠黏膜下神经元减少有关。

综上所述，我们推测，TNBS乙醇溶液引起结肠免疫反应导致细胞因子释放，从而激活并诱导COX-2的表达，可能使前列腺素合成增加，继而激活tau蛋白的磷酸化酶或(和)抑制去磷酸化酶，使tau蛋白高度磷酸化，进而影响微管的稳定性，使神经元变性，最终神经元数量减少，但是具体机制还待进一步研究。

［参考文献］

［1］Molodecky NA，Soon IS，Rabi DM，et al.Increasing incidence and prevalence of the inflammatory bowel diseases with time，based on systematic review［J］.Gastroenterology，2012，142(1) : 46-54.

［2］Villanacci V，Bassotti G，Nascimbeni R，et al.Enteric nervous system abnormalities in inflammatory bowel diseases［J］.Neurogastroenterol Moti，2008，20(9) : 1009-1016.

［3］Sanovic S，Lamb DP，Blennerhassett MG.Damage to the enteric nervous system in experimental colitis［J］.Am J Pathol，1999，155(4) : 1051-1057.

［4］Neurath M，Fuss I，Strober W.TNBS-colitis［J］.Int Rev Immunol，2000，19(1) : 51-62.

［5］刘兆霞，季万胜，刘晓丽，等.Ucn3及其受体CRFR2在肠易激综合征大鼠模型肠神经系统中的表达［J］.世界华人消化杂志，2012，20(13) : 1094-1099.

［6］Wakamatsu Y，Weston JA.Sequential expression and role of Hu RNA-binding proteins during neurogenesis［J］.Development，1997，124(17) : 3449-3460.

［7］Hendel J，Nielsen OH.Expression of cyclooxygenase-2 mRNA in active inflammatory bowel disease［J］.Am J Gastroenterology，1997，92(7) : 1170-1173.

［8］Roberts PJ，Morgan K，Miller R，et al.Neuronal COX-2 expression in human myenteric plexus in active inflammatory bowel disease［J］.Gut，2001，48(4) : 468-472.

［9］Kanai Y，Chen J，Hirokawa N.Microtubule bundling by tau proteins in vivo: analysis of functional domains［J］.EMBO J，1992，11(11) : 3953-3961.

［10］徐柯乐，陈勤，刘伟，等.远志皂苷减轻Aβ1-40诱导的AD大鼠脑神经元tau蛋白Ser396位点的过度磷酸化［J］.中国病理生理杂志，2012，28(9) : 1605-1609.

通讯作者△曲梅花Tel: 0536-8462466; E-mail: qumeihua@ hotmail.com;高志芹Tel: 0536-8462066; E-mail: zhiqingao@ wfmc.edu.cn

*［基金项目］山东省自然科学基金资助项目(No.ZR2009DM024; No.ZR2011HM043) ;山东省高等学校科技计划(No.J11LF33) ; 2013年山东省政府公派留学项目;山东省医药卫生计划(No.2014WS0478)

［收稿日期］2014-10-21

［文章编号］1000-4718(2015)06-1125-05

［中图分类号］R574.4

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.028