母体肢体缺血预处理对宫内窘迫胎鼠复氧后海马神经元线粒体结构和功能的影响*

卢　欢，郑晓春，陈小琳，吴希珠，郑官林

(1福建省妇幼保健院麻醉科，2福建医科大学省立临床学院，3福建省立医院麻醉科，福建福州350001)



母体肢体缺血预处理对宫内窘迫胎鼠复氧后海马神经元线粒体结构和功能的影响*

卢欢1，2，郑晓春2，3△，陈小琳1，吴希珠1，2，郑官林1，2

(1福建省妇幼保健院麻醉科，2福建医科大学省立临床学院，3福建省立医院麻醉科，福建福州350001)

［摘要］目的:探索母体肢体缺血预处理(LIP)对宫内窘迫胎鼠复氧后海马神经元线粒体结构和功能的影响。方法:将孕20 d的40只SD大鼠随机分为假手术组(S组)、LIP对照组、胎鼠宫内窘迫组(FD组)和LIP+ FD组。通过实验设计建立胎鼠宫内窘迫模型，观察各组胎鼠海马CA1区线粒体超微结构的变化;检测海马线粒体跨膜电位变化;测定海马组织活性氧簇(ROS)、三磷酸腺苷(ATP)、丙二醛(MDA)含量及锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性变化。结果: (1)与S组比较，FD组和LIP+ FD组电镜下观察胎鼠海马CA1区线粒体呈不同程度破坏，线粒体膜电位下降，ATP含量和Mn-SOD活性降低，ROS和MDA含量增加(P＜0.05)。(2)与FD组比较，LIP+ FD组胎鼠海马CA1区线粒体的超微结构保持较好的完整性，线粒体膜电位明显提高，海马ATP含量和Mn-SOD活性显著增高，ROS和MDA含量减少(P＜0.05)。结论:母体肢体缺血预处理对宫内窘迫胎鼠复氧后海马神经元线粒体功能具有保护作用。

［关键词］肢体缺血预处理;胎儿缺氧/复氧损伤;线粒体

［修回日期］2015-04-22

Effects of maternal limb ischemic preconditioning on structural and functional changes of mitochondria in fetal hippocampal neurons induced by intrauterine distress-reoxygenation in rats

LU Huan1，2，ZHENG Xiao-chun2，3，CHEN Xiao-lin1，WU Xi-zhu1，2，ZHENG Guan-lin1，2
(1Department of Anesthesiology，Fujian Maternity and Children Health Hospital，2Provincial Clinical Medical College，Fujian Medical University，3Department of Anesthesiology，Fujian Provincial Hospital，Fuzhou 350001，China.E-mail: zhengxc2@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effects of maternal limb ischemic preconditioning (LIP) on the mitochondrial structures and functions of the hippocampal neurons induced by reoxygenation in the intrauterine distress fetal rats.METHODS: Pregnant rats (n=40) were randomly divided into 4 groups: sham (S) group，LIP group，fetal distress (FD) group and LIP+ FD group.Intrauterine ischemia model was established through the experimental design.The ultrastructure of the mitochondria in CA1 area of the hippocampus was observed.The mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species (ROS) were measured.The content of ATP and MDA in the hippocampus tissue was detected.The activity of Mn-SOD was observed.RESULTS: Compared with sham group，the ultrastructure of mitochondria in CA1 area of the hippocampus was damaged in FD group and LIP+ FD group.The mitochondrial membrane potential，the content of ATP and the activity of Mn-SOD were decreased.However，the content of ROS and MDA was increased.Compared with FD group，the ultrastructure of mitochondria in CA1 area of the hippocampus was intact in LIP+ FD group.Furthermore，the reduced mitochondrial membrane potential and ATP content were inhibited.The activity of Mn-SOD was increased，but the content of ROS and MDA was decreased in LIP+ FD group.CONCLUSION: Limb ischemia preconditioning inhibits the damage the mitochondria of fetal hippocampal neurons induced by reoxygenation in the intrauterine distress fetal rats.

［KEY WORDS］Limb ischemia preconditioning; Fetal hypoxia/reoxygenation injury; Mitochondria

胎儿宫内窘迫是胎儿围产期死亡及新生儿神经系统后遗症的常见原因，严重威胁围产儿的健康［1］。胎儿宫内窘迫后应尽快恢复胎儿血流灌注，这缺氧/复氧过程对胎儿可造成缺血/再灌注损伤。肢体缺血预处理(limb ischemic preconditioning，LIP)即通过肢体的短时间缺血预处理，对缺血/再灌注损伤的远隔脏器如心、脑等产生内源性保护作用［2］。本研究建立胎鼠宫内窘迫模型，对孕鼠(母体)行LIP，以胎鼠(子体)海马线粒体为研究目标，通过对胎鼠海马线粒体结构及相关功能方面观察，探讨母体LIP是否能够通过胎盘屏障对宫内窘迫胎鼠缺血/再灌注损伤起保护作用。

材料和方法

1实验动物

清洁级成年SD大鼠56只，其中雌性42只，雄性14只，体重250～280 g，由福建医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号为SCXK(闽) 2012-0001。按雌雄比例3∶1于前1晚合笼，次日晨8点阴道涂片检查法确定交配后即可确定为孕1 d，孕20 d时随机抽取40只进行实验。

2模型构建与实验分组

2.1胎鼠宫内窘迫(fetal distress，FD)模型构建

取孕20 d大鼠麻醉后下腹正中切开，以无损伤小动脉夹钳夹近子宫处双侧子宫动静脉和卵巢动静脉，阻断子宫胎盘血供致胎鼠宫内窘迫，15 min后松开动脉夹，将子宫还纳入腹腔并缝合。

2.2 LIP模型的构建将橡皮筋紧紧地套扎在母鼠右侧腹股沟阻断右后肢血流(脉搏氧饱和度监测)，阻断/开放各5 min，循环3次进行母体LIP。

2.3实验分组取40只孕鼠按随机数字表法分成4组，每组10只。假手术(sham，S)组仅暴露子宫和卵巢的动静脉但不阻断; LIP组于母鼠右后肢实施LIP，其余同S组; FD组阻断子宫和卵巢的动静脉15 min后松开; LIP+ FD组阻断通向子宫和卵巢动静脉的同时行母鼠右后肢LIP。

3主要方法

3.1取材及标本处理取材对象为胎鼠。实验后24 h剖宫取胎鼠，每只孕鼠随机取活胎鼠6只，快速断头取脑，并在冰面上剥离海马。

3.2电镜观察海马CA1区神经元线粒体超微结构

海马CA1区取1 mm×1 mm×1 mm的组织3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定，乙醇-丙酮脱水，环氧树脂618包埋剂包埋;超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，飞利浦208型透射电镜观察、摄影。

3.3利用JC-1荧光染色-流式细胞术检测法检测海马线粒体膜电位试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所，参照试剂盒说明操作，检测JC-1单体时把激发光设置为490 nm，发射光设置为530 nm;检测JC-1聚合物时，把激发光设置为525 nm，发射光设置为590 nm。

3.4流式细胞术检测海马组织活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的含量试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所，参照试剂盒说明操作，流式细胞仪检测参数设置:激发光波长为488 nm，发射光波长为525 nm。

3.5海马组织锰-超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)含量的测定黄嘌呤氧化酶法测定Mn-SOD活性，用硫代巴比妥酸法检测MDA浓度，定磷法检测海马组织ATP含量变化，3种试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，测定步骤完全按照试剂盒说明书。

4统计学处理

应用SPSS 17.0统计学软件进行分析处理。各组数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多组间数据的两两比较采用Student-Newman-Keuls q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

1海马线粒体超微结构电镜观察结果

S组和LIP组可见核周线粒体丰富，形态基本正常，膜基本完整，结构清晰可辨，嵴密集，分布有序; FD组线粒体明显肿胀，结构模糊，嵴变短、嵴间隙增宽，排列紊乱，部分线粒体膜破碎，嵴完全消失，空泡形成; FD+ LIP组可见线粒体轻度肿胀，基质电子密度降低，嵴排列尚可，线粒体损伤较FD组明显减轻，见图1。

Figure 1.The ultrastructure of mitochondria in CA1 area of the fetal hippocampus under transmission electron microscope (×16 000).图1透射电镜观察各组胎鼠海马CA1区线粒体的超微结构

2母体LIP对宫内窘迫胎鼠复氧后海马线粒体膜电位影响

与S组相比较，FD组和LIP+ FD组线粒体膜电位显著降低(P＜0.05) ;而与FD组相比较，LIP+ FD组线粒体膜电位降低程度减轻(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.The effects of maternal LIP on mitochondrial membrane potential of fetal hippocampal neurons determined by flow cytometry with JC-1 fluorescent probe.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs FD group.图2母体LIP对胎鼠海马线粒体膜电位的影响

3母体LIP对宫内窘迫胎鼠复氧后海马ROS、MDA和ATP含量以及Mn-SOD活性的影响

与S组比较，LIP组胎鼠海马ROS含量、MDA含量、ATP含量及Mn-SOD活性无明显变化(P＞0.05) ;与S组比较，FD组和LIP+ FD组胎鼠海马ROS含量、MDA含量增加，ATP含量减少，Mn-SOD活性降低(P＜0.05) ;与FD组比较，LIP+ FD组胎鼠海马ROS含量、MDA含量明显降低，ATP含量及Mn-SOD活性显著增高(P＜0.05)，见图3、表1。

讨论

线粒体是细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所，是细胞内最为关键的细胞器之一。为此，寻找有效抑制线粒体结构受损及功能障碍方法成为脑缺血/再灌注损伤治疗中最为关键的目标。线粒体的正常形态、结构的维持需要足够的ATP，脑缺血过程，能量供应急剧减少，导致线粒体膜电位降低，同时线粒体通透性转换孔道开放，Na+、Ca2+和水分进入细胞增多，致线粒体肿胀、嵴断裂、消失等亚细胞结构的破坏;线粒体界膜可因高度肿胀而破裂，位于线粒体膜间隙的凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)、细胞色素C(cytochrome C，CytC)等释放至胞质或转位到胞核，激活caspase-3，导致细胞凋亡。细胞凋亡过程中，在细胞结构改变出现前，线粒体膜电位已经开始下降，线粒体膜电位是评价线粒体功能的重要指标［3］。实验结果显示母体LIP改善胎鼠脑缺血/再灌注损伤的能量代谢，抑制线粒体膜电位下降，保持胎鼠海马线粒体超微结构完整性，提高脑对缺血缺氧耐受力。

Figure 3.The changes of ROS fluorescence intensity in the fetal hippocampal tissues.图3各组胎鼠海马组织的ROS荧光强度

表1　各组胎鼠海马组织ROS含量、MDA含量、ATP含量及Mn-SOD活性Table 1.The effects of limb ischemic preconditioning on the levels of ROS，MDA，ATP and Mn-SOD in the fetal hippocampal tissues (Mean±SD.n=10)

缺血/再灌注后导致线粒体损伤的关键是氧化应激损伤［4］，主要表现为大量自由基生成，脂质过氧化产物(如MDA)增加，而机体抗氧化能力降低。有研究［5］表明LIP可减少再灌注期间自由基的生成，提高机体的抗氧化能力。脑缺血/再灌注时，抑制线粒体电子传递导致ROS产生增加，ROS攻击生物膜不饱和脂肪酸，引起膜脂质过氧化，脂质过氧化产物可引起多种酶类失活、DNA变形，破坏电子传递链、阻碍氧化磷酸化、增强溶酶体通透性、破坏正常的组织结构。线粒体内膜最靠近ROS产生位点，也成为最易被ROS攻击对象。然而机体形成了自身的抗氧化防御体系，其中Mn-SOD是机体重要氧自由基清除剂，主要存在于线粒体的基质中，是线粒体清除氧自由基的第一道防线。我们的实验发现经过母体LIP胎鼠海马组织中的ROS含量、MDA含量降低，Mn-SOD活性提高，提示LIP能够直接通过提高线粒体对ROS的清除力、减少膜的脂质过氧化损伤，对脑缺血/再灌注损伤发挥保护作用。

本课题组前期研究［6］已经证实母体LIP可减轻宫内窘迫胎鼠复氧后海马神经元的凋亡。本研究从海马线粒体形态学及相关功能方面观察，表明母体LIP产生的机体内源性保护作用可以通过胎盘屏障对宫内窘迫胎鼠复氧后起脑保护作用，为减轻宫内窘迫胎儿中枢神经系统缺氧/复氧损伤提供新思路，其机制可能与抑制线粒体氧化应激损伤有关。母体LIP产生的内源性保护因子是通过何种转导通路透过胎盘屏障对胎鼠脑起保护作用将在后续研究中深入探讨。

［参考文献］

［1］Leone TA，Finer NN.Shock: a common consequence of neonatal asphyxia［J］.J Pediatr，2011，158(2 Suppl) : e9-e12.

［2］Hess DC，Hoda MN，Bhatia K.Remote limb preconditioning and postconditioning: will it translate into a promising treatment for acute stroke?［J］.Stroke，2013，44 (4) :1191-1197.

［3］DuchenMR.Roles of mitochondria in health and disease ［J］.Diabetes，2004，53(Suppl 1) : S96-S102.

［4］Guillot M，Charles AL，Chamaraux-Tran TN，et al.Oxidative stress precedes skeletal muscle mitochondrial dysfunction during experimental aortic cross-clamping but is not associated with early lung，heart，brain，liver，or kidney mitochondrial impairment［J］.J Vasc Surg，2014，60 (4) :1043-1051.e5

［5］Pei H，Wu Y，Wei Y，et al.Remote ischemic preconditioning reduces perioperative cardiac and renal events in patients undergoing elective coronary intervention: a metaanalysis of 11 randomized trials［J］.PLoS One，2014，9 (12) : e115500.

［6］吴希珠，郑晓春，陈小琳，等.母体肢体缺血预处理对宫内窘迫胎鼠复氧后海马神经元凋亡的影响［J］.中国病理生理杂志，2014，30(4) :729-732，750.

通讯作者△Tel: 0591-88216136; E-mail: zhengxc2@163.com

*［基金项目］福建省自然科学基金资助项目(No.2013J01116) ;福建省卫生厅青年研究基金资助项目(No.2013-2-2)

［收稿日期］2015-02-04

［文章编号］1000-4718(2015)06-1120-05

［中图分类号］R364.4; R363.2

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.027