四氢嘧啶类衍生物ZL-5015抗内毒素作用的实验研究*

邱小惠， 林 嘉， 余传林， 陈娜娜， 雷林生

(南方医科大学药学院，广东 广州510515)

四氢嘧啶类化合物具有多种生物活性，其中之一为抗炎镇痛。文献报道，6-氨基-4-酮-1，3-二苯基-2-硫代-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-羰基衍生物可抑制白细胞介素8诱导的中性粒细胞的趋化作用［1］。3-(1-取代苯乙酮基)-4-(取代苯基)-1，2，3，4-四氢嘧啶-5-羧酸衍生物对大鼠佐剂性关节炎效果明显［2］。某些4，5，6-三苯基-1，2，3，4-四氢嘧啶衍生物具有环氧化酶 2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制活性［3-4］。本实验室曾报道，1，3-取代基-1，2，3，6-四氢嘧啶-4，5-二甲酸二乙酯类化合物具有良好的抗炎镇痛作用［5-6］，其中，1，3-二环戊基-1，2，3，6-四氢嘧啶-4，5-二甲酸二乙酯(ZL-5015)具有抗炎及免疫抑制双重作用，体外实验证明其可抑制细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的促炎细胞因子肿瘤坏死因子的分泌，同时可促进抑炎细胞因子IL-10的分泌［6］，提示其具有抗内毒素作用。据此，本文探讨了ZL-5015对内毒素所致小鼠中毒死亡的作用及初步机制。

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物 健康SPF级C57BL/6J小鼠，雌雄不限，体质量18～20 g，由南方医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK(粤)2011-0015。

1.2 主要试剂 ZL-5015参照文献方法［7］合成，采用硅胶柱分离纯化，其结构经13C-NMR、1H-NMR和MS确证;灌胃给药时，采用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制;体外实验时先采用二甲基亚砜(DMSO)配制成储存液，然后用完全培养基稀释成工作液，使DMSO的终浓度为0.1%。小鼠IL-1β、IL-10和TNF-α检测试剂盒(eBioscience);TRIzol(Invitrogen);mRNA逆转录试剂盒及real-time PCR试剂盒(Bioteke);DMEM高糖培养液(Thermo);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司);铜绿假单胞菌LPS(Sigma);地塞米松(dexamethasone，Dex)磷酸钠注射液(广州白云山天心制药股份有限公司);其它试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器 多功能酶标仪(Tecan);PCR仪(Bio-Rad);实时定量PCR仪(Stratagene);CO2培养箱(Thermo);台式冷冻型高速离心机(Eppendorf);电子分析天平(Denver Instrument)。

2 主要方法

2.1 内毒素致死模型实验 取小鼠80只，雌雄各半，随机分为5组，每组16只，即:LPS组:灌胃0.5%CMC-Na的水溶液10 mL/kg体重;ZL-5015(高、中和低剂量)+LPS组:分别以200和100、50 mg/kg的ZL-5015灌胃;Dex+LPS组:皮下注射地塞米松10 mg/kg。给药后30 min，每组动物均腹腔注射内毒素70 mg/kg，之后，每6 h 1次，观察3 d内动物死亡情况。LPS和ZL-5015的剂量选择由预实验结果确定。

2.2 内毒素血症模型实验

2.2.1 待测化合物对血清炎症相关细胞因子影响的时效动态研究 取小鼠100只，雌雄各半，随机分为2组，每组50只，即LPS组:灌胃0.5%CMC-Na的水溶液10 mL/kg体重;ZL-5015(高剂量)+LPS组:以200 mg/kg的 ZL-5015灌胃。给药后0.5 h，2组小鼠均腹腔注射内毒素70 mg/kg，分别于注射后1、3、6、9、12 h，每组取 10 只小鼠，经眼球取血，将血液收集于1.5 mL的EP管中，室温倾斜放置1 h，待血清充分析出后，2 000 r/min离心5 min，收集血清用于IL-1β、IL-10和TNF-α的测定。

2.2.2 待测化合物作用的剂量依赖关系研究 动物分组及给药同2.1所述，每组10只小鼠。注射LPS后3 h，经眼球取血，按2.2.1节所述分离血清用于IL-1β、IL-10和TNF-α的测定。

2.3 内毒素体外致炎实验

2.3.1 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 采用文献［6］方法获取小鼠腹腔巨噬细胞，用完全培养基接种于6孔板中，每孔3×106个细胞，在饱和湿度、5%CO2、37℃条件下培养24 h让其充分贴壁，然后用Hanks液洗弃未贴壁细胞后用于以下实验。

2.3.2 实验分组与处理 共分为6组，即空白(blank)对照组:仅含完全培养基;LPS组:含完全培养基和LPS(10 mg/L);ZL-5015(高、中、低浓度)+LPS 组:含完全培养基、ZL-5015(40、20、10 μmol/L)和LPS;Dex+LPS组:含完全培养基、地塞米松(1 μmol/L)和LPS。各组DMSO的终浓度均为0.1%，继续培养24 h后，收集上清液分别用于IL-1β、IL-10和TNF-α含量的测定;然后提取细胞中的总RNA用于上述细胞因子mRNA表达水平的测定。

2.4 IL-1β、IL-10和 TNF-α 含量的检测 采用ELISA方法，测定步骤严格按照试剂盒说明进行操作，最后用酶标仪测量450 nm波长处的吸光度，通过标准曲线回归方程计算出相应的含量。

2.5 实时定量PCR检测mRNA的表达水平 PCR引物由英潍捷基贸易有限公司合成。IL-1β的上游引物为 5’-TCCAGGATGAGGACATGAGCAC-3’，下游引物为 5’-GAACGTCACACACCAGCAGGTTA-3’;IL-10的上游引物为 5’-GACCAGCTGGACAACATACTGCTAA-3’，下游引物为 5’-GATAAGGCTTGGCAACCCAAGTAA-3’;TNF-α 的上游引物为 5’-AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3’，下游引物为 5’-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3’;GAPDH 的上游引物为5’-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3’，下游引 物 为 5’-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3’。采用TRIzol试剂提取总RNA，然后取1 μg的总RNA逆转录合成cDNA，接着以 cDNA为模板扩增IL-1β、IL-10、TNF-α及内参照GAPDH，逆转录及基因片段扩增依试剂盒提供的方法进行。逆转录条件为:30℃10 min;42℃ 60 min;95℃ 5 min。扩增条件为95℃2 min;95℃ 20 s;60℃ 20 s，72℃ 60 s，共40循环;结果采用2－ΔΔCt进行相对定量分析。

3 统计学处理

采用SPSS 11.5统计软件对实验数据进行统计分析。小鼠死亡率采用Kaplan-Meier法分析，时效动态实验某一时点的均数比较采用独立样本t检验，其他数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐时采用LSD法、不齐时采用Dunnett’s T3法进行组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 ZL-5015提高致死剂量内毒素攻击小鼠的存活率和存活时间

腹腔注射致死剂量(70 mg/kg)LPS后，小鼠先是出现烦躁多动，毛色失去光泽，继之行动迟缓，逐渐蜷缩在一起，对外来刺激无反应，拒食。24 h后动物开始死亡，存活动物会阴部污秽潮湿，生命垂危。48 h后仍存活的动物逐渐恢复正常活动与摄食。各组动物生存情况见图1，统计分析表明，模型组动物存活率为12.50%;高、中和低剂量(200、100和50 mg/kg)实验组动物存活率分别为37.50%、31.25%和18.75%;Dex+LPS组存活率为87.50%。与模型组比较，高、中剂量ZL-5015组和Dex组动物存活率均增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

Figure 1.The effect of ZL-5015 on survival rate and survival time of the mice subjected to lethal LPS challenge.Mean±SD.n=15.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs LPS group.图1 ZL-5015对内毒素中毒小鼠存活率和存活时间的影响

2 ZL-5015体内给药抑制内毒素诱导小鼠促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的产生，提高抑炎细胞因子IL-10的水平

LPS组小鼠经腹腔注射LPS 1 h后，血清中TNF-α和IL-10的水平达峰值，之后逐渐下降，6 h后维持在低水平。给予LPS 3 h后，血清IL-1β才有明显升高，之后呈现平台状，12 h后再度升高。经ZL-5015预处理的动物再注射LPS，其血清中IL-1β和TNF-α的水平明显低于LPS组，相反，处理组动物血清中IL-10的水平高于LPS组，在1 h和3 h时差异显著(P＜0.05)，见图2。如表1所示，给予LPS 3 h后，ZL-5015预处理剂量为100和200 mg/kg时，与LPS组相比，IL-1β的下降显著(P＜0.01);剂量为50、100和200 mg/kg时，TNF-α的下降与LPS组相比具有统计学意义(P＜0.05)。相反，ZL-5015处理组血清中IL-10的水平略高于模型组，剂量为100和200 mg/kg时，差异显著(P＜0.05)。

Figure 2.Time course of the effect of ZL-5015(200 mg/kg)on serum levels of TNF-α，IL-1β and IL-10 in LPS-induced mice.Mean±SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs LPS group.图2 ZL-5015对内毒素诱导小鼠血清炎症相关细胞因子水平影响的时效动态关系

表1 ZL-5015对内毒素诱导小鼠血清炎症相关细胞因子水平的影响Table 1.The effect of ZL-5015 on serum levels of inflammation-associated cytokines in LPS-induced mice(Mean±SD.n=10)

3 ZL-5015体外抑制内毒素诱导的小鼠腹腔巨噬细胞产生促炎细胞因子IL-1β和TNF-α，促进抑炎细胞因子IL-10的产生

如表2所示，在体外培养的条件下，正常小鼠腹腔巨噬细胞能分泌少量的IL-1β和TNF-α，IL-10的分泌量尚未达到试剂盒检测的最低值，经LPS刺激以后，3种细胞因子的含量大幅增加，在 ZL-5015(10、20 和 40 μmol/L)存在的情况下，LPS 诱导 IL-1β和TNF-α的分泌作用明显下降，与LPS组相比具有统计学意义(P＜0.05);相反，对IL-10的分泌具有轻度的促进作用，浓度为20和40 μmol/L时与LPS模型组相比差异显著(P＜0.01)。

表2 ZL-5015对内毒素诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生炎症相关细胞因子的影响Table 2.Effect of ZL-5015 on production of inflammation-associated cytokines in LPS-induced mouse peritoneal macrophages in vitro(Mean±SD.n=6)

4 ZL-5015体外抑制内毒素诱导的小鼠腹腔巨噬细胞促炎细胞因子IL-1β和TNF-α mRNA的表达，促进抑炎细胞因子IL-10 mRNA的表达

如表3所示，在体外培养的条件下，正常小鼠腹腔巨噬细胞表达少量的IL-1β、TNF-α和IL-10 mRNA，经LPS刺激以后，3种细胞因子的mRNA表达量明显增加，在 ZL-5015(10、20 和 40 μmol/L)存在的情况下，LPS诱导IL-1β和TNF-α的mRNA的表达量明显下降(P＜0.01);相反，对IL-10的表达具有轻度的促进作用，浓度为20和40 μmol/L时与LPS组相比差异显著(P＜0.05)。

表3 ZL-5015对内毒素诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达炎症相关细胞因子mRNA的影响Table 3.The effect of ZL-5015 on mRNA expression of inflammation-associated cytokines in LPS-induced mouse peritoneal macrophages in vitro(Mean±SD.n=6)

讨 论

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的结构成分，其化学本质为LPS。在创伤、感染引起的全身炎症反应综合征及脓毒症中，内毒素是重要的致病因子，严重时可导致休克、弥漫性血管内凝血和多器官功能衰竭、甚至死亡。一般认为，抗内毒素治疗是提高脓毒症治疗效果的关键环节之一［8］，因此，寻找有效的抗内毒素药物具有重要的临床意义。

本研究结果显示，四氢嘧啶类化合物ZL-5015具有抗内毒素作用，表现为提高被致死量内毒素攻击小鼠的存活率和延长存活时间，体内外均能抑制内毒素诱导的促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的产生，提高抑炎细胞因子IL-10的水平，提示该类化合物在治疗内毒素血症方面的应用前景。

TNF-α和IL-1β是重要的促炎细胞因子，参与多种炎症反应，在内毒素血症时，血中TNF-α和IL-1β的水平大幅升高，因此，在研究化合物的抗炎、抗内毒素作用时，TNF-α和IL-1β是经常被选用的评价指标［9-10］。本实验室曾报道ZL-5015体外能抑制TNF-α的分泌［6］，本研究从体内、体外两个层次观察了ZL-5015对TNF-α产生的影响，并增加IL-1β作为另一促炎细胞因子的评价指标。结果发现，ZL-5015在剂量为100和200 mg/kg时能降低内毒素诱导的小鼠血清 TNF-α和 IL-1β的水平，体外在浓度为10 μmol/L以上时能抑制内毒素诱导的小鼠巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β，并能抑制其mRNA的表达，提示ZL-5015的抗内毒素作用与抑制TNF-α和IL-1β的表达与产生有关。

IL-10是公认的抑炎细胞因子，具有抗炎和免疫抑制作用［11］，本实验室曾报道ZL-5015体外能促进IL-10的分泌［6］，在此基础上，本研究从体内、体外两个层次观察了ZL-5015对IL-10产生及其mRNA表达的影响。结果发现，ZL-5015在剂量为100和200 mg/kg时对内毒素攻击小鼠血清中IL-10的水平有一定的提升作用，体外在浓度为20 μmol/L以上时能促进内毒素诱导小鼠巨噬细胞分泌IL-10，并能促进其mRNA的表达，提示促进IL-10的表达和产生与ZL-5015的抗内毒素作用有关。这一点与甾体类抗炎药地塞米松不同，后者体外对LPS刺激的小鼠巨噬细胞表达和分泌IL-10有轻微的抑制作用，说明ZL-5015的作用机制不同于甾体类抗炎药。在体内情况下，由于地塞米松还能促进其它免疫细胞分泌IL-10［12］，因此其综合作用表现为轻度提升内毒素诱导的小鼠血清IL-10水平。

虽然ZL-5015能提高被致死量内毒素攻击小鼠的存活率和延长存活时间，但存活率提高的幅度远低于地塞米松，说明其抗内毒素的作用较弱。从时效关系的动态数据看，在内毒素攻击后6 h内能抑制TNF-α和IL-1β的产生，提高IL-10的水平，6 h后作用明显下降，提示其作用维持时间短。总之，从现有实验数据看，ZL-5015本身应用的可能性不大，但是，可以将ZL-5015作为先导化合物进行结构改造，克服现有的不足，从而获得活性更高、维持时间更长的同类化合物，用于内毒素血症及相关疾病的治疗或辅助治疗。

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