重组可溶性人CD40L诱导人脐静脉内皮细胞损伤*

刘红利，陈　檬，王宏涛，，吴以岭，，△［南京中医药大学，江苏南京00;河北以岭医药研究院，国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)，河北省络病重点实验室，河北石家庄05005］



重组可溶性人CD40L诱导人脐静脉内皮细胞损伤*

刘红利1，陈檬2，王宏涛2，3，吴以岭1，2，4△
［1南京中医药大学，江苏南京210023;2河北以岭医药研究院，3国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)，4河北省络病重点实验室，河北石家庄050035］

［摘要］目的:探讨重组可溶性人CD40L(rshCD40L)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的损伤作用及其在动脉粥样硬化中的作用。方法:应用rshCD40L刺激人脐静脉内皮细胞12 h; MTS法观察HUVECs的生存活性，ELISA法测内皮细胞E-选择素(E-selectin)、细胞间黏附分子(ICAM) -1、组织因子(TF)、组织因子途径抑制物(TFPI)表达的变化，比色法测脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果:与正常组比较，不同浓度的rshCD40L(0.5、1、2、3 mg/L)对内皮细胞的生存活性无明显影响; 0.5 mg/L rshCD40L即可增加内皮细胞E-selectin、sICAM-1、TF、TFPI的分泌，差异有统计学意义(P＜0.01)，同时增加内皮细胞MDA的含量、降低SOD活性(P＜0.05)。结论: 0.5～3 mg/L rshCD40L对内皮细胞生存活性无明显影响，但已经引起内皮细胞功能障碍，增加内皮细胞炎症和外源性凝血反应，诱导内皮细胞脂质过氧化物损，使其抗氧化能力下降。

［关键词］重组可溶性人CD40L;人脐静脉内皮细胞;动脉粥样硬化

［修回日期］2015-03-03

Injury effect of recombinant soluble human CD40 ligand on human umbilical vein endothelial cells

LIU Hong-li1，CHEN Meng2，WANG Hong-tao2，3，WU Yi-ling1，2，4
［1Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China;2Hebei Yiling Medical Research Institute，3Key Research Centre of State Administration of Traditional Chinese Medicine (Collateral Disease of Cardiovasculature)，4Key Laboratory of Collateral Disease of Hebei Province，Shijiazhuang 050035，China.E-mail: weitcm@163.com］

［ABSTRACT］AIM: To investigate the damage in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by recombinant soluble human CD40 ligand (rshCD40L).METHODS: The cultured HUVECs were treated with rshCD40L for 12 h.The survival activity of the HUVECs was observed by MTS assay.The expression of E-selectin，intercellular adhesion molecule (ICAM) -1，tissue factor (TF) and tissue factor pathway inhibitor (TFPI) was measured by ELISA.The activity of superoxide dismutase (SOD) and the level of malondialdehyde (MDA) were detected by the methods of thibabituric acid (TBA).RESULTS: Compared with normal group，different concentrations of rshCD40L (0.5，1，2，3 mg/L) had no obvious effect on the survival activity of the HUVECs (P＞0.05).rshCD40L at concentration of 0.5 mg/L promoted the secretion of E-selectin，sICAM-1，TF and TFPI in the HUVECs (P＜0.01).rshCD40L at concentration of 0.5 mg/L also increased MDA content and reduced the activity of SOD in the HUVECs (P＜0.05).CONCLUSION: 0.5～3mg/L rshCD40L has no obvious effect on endothelial cell survival，but already causes endothelial dysfunction by increasing endothelial inflammation and exogenous coagulation reaction，inducing lipid peroxides injury and reducing antioxidant capacity.

［KEY WORDS］Recombinant soluble human CD40 ligand; Human umbilical vein endothelial cells; Atherosclerosis

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是众多心脑血管疾病的病理基础，其发病机制复杂，涉及到炎症因子、脂质代谢、凝血因素、免疫缺陷和遗传等多种因素相互作用，其中内皮细胞功能障碍是AS的始动环节并贯穿于全过程［1］。CD40/CD40L属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和肿瘤坏死因子受体超家族，在免疫炎症网络反应中起重要的桥梁作用。国外研究学者认为CD40L的持续上调及其促血栓形成和促炎作用是临床卒中患者慢性期转归差的因素之一［2］。在我国，也有研究发现血液中CD40L的单核苷酸多肽性与急性冠脉综合征的病变程度相关，是其独立的危险因素之一［3］。本研究采用重组可溶性人CD40L(recombinant soluble human CD40 ligand，rshCD40L)刺激体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，通过观察rshCD40L刺激HUVECs后内皮细胞生存活性、炎症因子、凝血相关因子和氧化损伤的变化来评价rshCD40L对内皮细胞的损伤作用，进一步探讨CD40L在AS发病机制中的作用。

材料和方法

1细胞、试剂和仪器

人脐静脉内皮细胞株(上海中国科学院细胞库)接种于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中(内含青霉素1×108U/L，硫酸链霉素1×108U/L，庆大霉素5×107U/L)，37℃、5% CO2孵箱传代培养，待细胞融合至80%时进行分组干预。

rshCD40L(Miltenyi Biotec)以去离子水配成250 mg/L储备溶液，除菌过滤，－20℃保存备用，使用前以含0.1% BSA的磷酸盐缓冲液稀释到适当浓度。DMEM高糖培养基、MTS试剂(Promega) ; E-选择素(E-selectin)试剂盒(Ray Bio) ;可溶性细胞间黏附分子(soluble intercellular adhesion molecule，sICAM-1)试剂盒(R＆D) ;组织因子(tissue factor，TF)、组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)试剂盒(Assaypro) ;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

Forma 371细胞CO2培养箱(Thermo Scientific) ;多功能酶标仪(BioTek) ; KA-1000A飞鸽牌离心机(上海安亭科学仪器厂)。

2方法

2.1 MTS法检测rshCD40L诱导内皮细胞的生存活性取对数生长期的人脐静脉内皮细胞以1×105接种于96孔培养板内，在上述条件下培养24 h后，更换不含血清的培养基，模型组加入rshCD40L使其终浓度分别为0.5、1、2、3 mg/L，正常组不加rshCD40L干预，每组设4个复孔，继续贴壁培养12 h。弃去旧培养液，每孔加100 μL MTS孵育1 h，在多功能酶标仪上于570 nm处测定吸光值(A值)。

2.2rshCD40L诱导内皮细胞表达E-selectin、sICAM-1、TF和TFPI对数生长期的人脐静脉内皮细胞以1×105接种于96孔培养板内，在上述条件下培养24 h后，更换不含血清的培养基，模型组加入rsh-CD40L使其终浓度为0.5 mg/L，正常组不加rsh-CD40L干预，每组4个复孔继续贴壁培养12 h。收集每孔细胞上清液，严格按照各试剂盒说明书进行操作。

2.3比色法测rshCD40L诱导HUVECs MDA和SOD的含量对数生长的人脐静脉内皮细胞以1× 105接种于6孔培养板内，在上述条件下培养24 h后，更换不含血清的培养基，模型组加入rshCD40L使其终浓度为0.5 mg/L，正常组不加rshCD40L干预，继续贴壁培养12 h。弃去培养基，5%胰酶消化收集细胞，生理盐水清洗2遍，超声破碎，收集细胞裂解液，取2 μL进行蛋白定量，剩余细胞裂解液按试剂盒说明书操作检测。

3统计学处理

所有实验数据均采用软件SPSS 17.0行统计学分析。计量数据用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 rshCD40L对HUVECs生存活性的影响

与正常组比较，0.5 mg/L的rshCD40L轻微降低内皮细胞的生存活性，但差异无统计学意义。随着rshCD40L浓度的增加，各组对内皮细胞生存活性的影响与正常组比较及各组间比较均无显著差异(P＞0.05)，见图1。后续实验采用0.5 mg/L浓度刺激内皮细胞。

Figure 1.The effect of rshCD40L at different concentrations on the cell viability of HUVECs.Mean±SD.n=4.图1 rshCD40L不同浓度组的细胞存活率

2 rshCD40L对HUVECs表达E-selectin、sICAM-1、TF和TFPI的影响

与正常组比较，0.5 mg/L的rshCD40L孵育内皮细胞12 h可刺激内皮细胞培养液中黏附分子E-selectin、sICAM-1表达增加，促进组织因子TF表达，同时降低TFPI水平，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

表1　 rshCD40L对内皮细胞不同细胞因子表达的影响Table 1.The effects of rshCD40L on the expression of different cytokines in HUVECs (Mean±SD.n=4)

3 rshCD40L对HUVECs MDA含量和SOD活性的影响

与正常组比较，0.5 mg/L的rshCD40L孵育内皮细胞12 h可显著升高细胞裂解液中MDA的含量，降低SOD活性，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2　 rshCD40L对内皮细胞MDA含量和SOD活性水平变化的影响Table 2.The effects of rshCD40L on the changes of MDA and SOD in the HUVECs (Mean±SD.n=4)

讨论

CD40与CD40L属于TNF受体/TNF超家族成员，为跨膜糖蛋白，表达于多种与AS相关的细胞表面［4］，如内皮细胞、血小板、巨噬细胞、平滑肌细胞和T细胞等，两者以配体-受体结合的形式诱导细胞内信号级联反应发挥生物学效应，促进动脉粥样硬化相关基因表达，在AS早期内皮细胞功能障碍、粥样斑块不稳定性和血栓形成过程中均是重要的参与者［5-6］。其中CD40L主要表达在活化的T淋巴细胞、B细胞和血小板上，血小板活化后，可在数分钟内将内部储存的CD40L迅速转移至膜表面并在蛋白水解酶的作用下从膜表面脱落形成可溶性的CD40L，有研究资料显示，血液中95%的sCD40L是由血小板活化后释放的［7］，sCD40L具有CD40L相同的生物学作用。

内皮细胞是血管内膜的屏障，直接受到各种危险因素的刺激而发生功能和结构改变，其功能障碍则是AS发生发展的关键环节。正常内皮细胞可表达CD40受体，体内存在或体外给予外源性的可溶性CD40L均能与内皮细胞CD40结合相互作用诱导内皮细胞内信号转导，激活黏附分子、炎症因子、趋化因子等的表达，促进单核细胞、淋巴细胞、血小板黏附到血管内皮细胞，形成AS早期炎症反应并加速斑块形成［8-9］。有研究表明，CD40L还可通过激活PI3K信号通路增加活性氧的表达［10］;上调内皮细胞表达基质金属蛋白酶家族，降解斑块成分，使斑块易于破裂增加斑块的不稳定性［11］; CD40/CD40L还可调节内皮细胞的促凝活性，促发血栓形成［12］。本研究结果显示0.5 mg/L的rshCD40L即可显著增强内皮细胞表达E-selectin和sICAM-1，与之前的研究结果相符。E-selectin和sICAM-1表达增多加强了炎症细胞向血管内皮细胞趋化黏附的作用，扩大局部的炎症反应。TF与TFPI是体内维持凝血系统和纤溶系统平衡的相互制约的一对因子，有研究发现内皮细胞凝血活性增强是AS血栓形成的主要病理基础［13］。本研究同样观察到0.5 mg/L的rshCD40L不仅增加内皮细胞TF表达，促使纤维蛋白原向纤维蛋白转化，发挥促凝效应，同时还能够降低凝血因子途径抑制物(TFPI)的表达，使抗凝功能紊乱。既往研究证实，AS患者和动物模型中均有氧自由基损伤，机体的脂质过氧化物和抗氧化系统稳态失衡，导致体内大量氧自由基蓄积，脂质过氧化反应剧烈，最终引起细胞结构损伤和功能紊乱，细胞凋亡、坏死。MDA是脂质过氧化产物，其含量的高低常被用来评价机体受氧化损伤程度轻重的重要检测指标，而SOD则可以清除体内过多的氧自由基，抑制氧化应激反应。对于CD40L是否可以引起内皮细胞过氧化损伤鲜有报道。本实验结果发现，rshCD40L刺激作用下的内皮细胞MDA含量显著升高，而SOD活性则明显下降，提示CD40L可诱导内皮细胞氧自由基损伤，降低内皮细胞抗氧化能力，破坏内皮细胞功能，可能为CD40/CD40L促进动脉粥样硬化发生、发展的另一机制。另外，既往研究多提示CD40L对多种肿瘤细胞具有促凋亡和抑增殖作用，本研究发现，不同浓度的rshCD40L对内皮细胞的生存活性则无明显影响，分析原因可能为肿瘤的免疫抑制特点，CD40/CD40L能够为B细胞、T细胞提供活化的第一、第二信号，增加树突状细胞的抗原递呈能力，控制癌细胞生长;另外，细胞间的相互作用不仅仅通过CD40/CD40L通路发挥损伤效应，同时存在其它机制协同扩大损伤反应，从而诱导细胞凋亡，而本研究中采用单因素的细胞因子造模，损伤程度相对减轻。尽管rshCD40L不能引起内皮细胞生存活性改变，但内皮细胞分泌的黏附分子(E-selectin、sICAM-1)、组织因子(TF)、脂质过氧化物(MDA)等损伤因子增多，而保护因子如TFPI、SOD则明显减少，提示我们内皮细胞此时已经发生了早期功能障碍，处于应激-自我修复状态。总之，rshCD40L能通过促进内皮细胞的炎症、凝血反应，增加氧化应激反应来损伤内皮细胞，引起内皮细胞早期功能障碍。

减轻内皮细胞功能障碍、修复内皮细胞生理功能并早期发现能代表内皮细胞功能障碍的生物标志物对于动脉粥样硬化的防治起重要作用。一些药物如他汀类、氯吡格雷和传统中医中药等发挥抗动脉粥样硬化作用也与其能够调节CD40/CD40L有关［14-16］。因此，针对CD40/CD40L进行早期干预、防治对内皮细胞功能损伤也成为动脉粥样硬化治疗的一个策略。［参考文献］

［1］Poredos P.Endothelial dysfunction in the pathogenesis of atherosclerosis［J］.Int Angelol，2002，21(2) :109-116.

［2］van Kooten F，Ciabattoni G，Koudstaal PJ，et al.Increased platelet activation in the chronic phase after cerebral ischemia and intracerebral hemorrhage［J］.Stroke，1999，30(3) :546-549.

［3］买尼沙·买买提，刘冬青，孟宪明，等.中国维吾尔族、汉族人群CD40L单核苷酸基因多态性与急性冠脉综合征的相关性［J］.中国老年学杂志，2014，34(5) : 1198-1202.

［4］Schonbeck U，Libby P.The CD40/CD154 receptor/ligand dyad［J］.Cell Mol Life Sci，2001，58(1) :4-43.

［5］André P，Nannizzi-Alaimo L，Prasad SK，et al.Plateletderived CD40l the switch-hitting player of cardiovascular disease［J］.Circulation，2002，106(8) :896-899.

［6］Lievens D，Zernecke A，Seijkens T，et al.Platelet CD40L mediates thrombotic and inflammatory processes in atherosclerosis［J］.Blood，2010，116(20) :4317-4327.

［7］Henn V，Steinbach S，Buchner K，et al.The inflammatory action of CD40 ligand (CD154) expressed on activated human platelets is temporallylimited by coexpressed CD40 ［J］.Blood，2001，98(4) :1047-1054.

［8］Danese S，Fioeehi C.Platelet activation and the CD40/CD40 ligand pathway: mechanisms and implications for human disease［J］.Crit Bey Immunol，2005，25(2) : 103-121.

［9］渠晶，赵爱平，丁卜同，等.体内活化血小板表达CD40L及其对内皮细胞表达炎性因子的影响［J］.山东大学学报:医学版，2014，52(3) :75-78.

［10］Xia M，Li G，Ma J，et al.Phosphoinositide 3-kinase mediates CD40 ligand-induced oxidative stress and endothelial dysfunction via Rac1 and NADPH oxidase 2［J］.J Thromb Haemostasis，2010，8(2) :397-406.

［11］Martínez de Lizarrondo S，Roncal C，Calvayrac O，et al.Synergistic effect of thrombin and CD40Lon endothelial MMP-10 expression and microparticle generation in vitro and in vivo［J］.Arte-rioscle Thromb Vasc Biol，2012，32 (6) : E1477-1487.

［12］Peterson JT，Li H，Dillon L，et al.Evolution of matrix metalloprotease and tissue inhibitor expression during heart failure progression in the infarcted rat［J］.Cardiovasc Res，2000，46(2) :307-315.

［13］Steffer J，Luscher TF，Tanner FC.Tissue factor in cardiovascular diseases: molecular mechanisms and clinical implications［J］.Circulation，2006，113(5) :722-731.

［14］Zhang XX，Duan W，We WB，et al.Effect of clopidogrel on platelet membrane CD40 ligand in coronary artery disease patients under taking percutaneous coronary intervention［J］.South China J Cardiol，2007，8(3) :133-134.

［15］秦合伟，刘萍.冠心康对载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉粥样斑块及CD40L表达的影响［J］.中华中医药学刊，2014，32(8) :1923-1926.

［16］尹明景，温汉春，叶永维，等.高盐高脂摄入致大鼠主动脉重构及辛伐他汀的阻断作用［J］.中国病理生理杂志，2012，28(2) :228-233.

通讯作者△Tel: 0311-85901553; E-mail: weitcm@163.com

*［基金项目］国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(No.2012CB518606)

［收稿日期］2014-10-15

［文章编号］1000-4718(2015)06-1111-04

［中图分类号］R363

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.025