转录因子c-Jun调控成骨细胞Mepe基因表达的研究*

张娟娟，刘宗霞，孙　岩(潍坊医学院口腔学院口腔医学研究所，山东潍坊261053)



转录因子c-Jun调控成骨细胞Mepe基因表达的研究*

张娟娟，刘宗霞，孙岩△
(潍坊医学院口腔学院口腔医学研究所，山东潍坊261053)

［摘要］目的:探讨转录因子c-Jun对Mepe基因的转录调控作用，并寻找c-Jun在Mepe启动子上的特异性结合位点。方法:利用免疫组织化学方法定位c-Jun与Mepe在小鼠骨组织的表达;采用real-time PCR的方法检测c-Jun的表达量改变对Mepe mRNA表达的影响;应用双萤光素酶报告基因检测系统及定点突变技术分析c-Jun对Mepe基因启动子转录活性的影响。结果:转录因子c-Jun在小鼠骨细胞胞核中呈阳性表达，而Mepe在小鼠骨细胞的胞浆中有表达; real-time PCR显示c-Jun过表达后，Mepe mRNA的表达显著增加(P＜0.05) ;双萤光素酶报告基因检测系统检测显示，在成骨细胞中转染pCMV-3Tag-1-c-Jun的实验组Mepe启动子的转录活性升高(P＜0.05) ;定点突变c-Jun的潜在结合位点后，Mepe启动子的转录活性显著下降(P＜0.05)。结论:转录因子c-Jun可通过Mepe启动子上潜在的c-Jun结合位点上调成骨细胞中该基因的转录。

［关键词］转录因子c-Jun;细胞外基质磷酸化糖蛋白;成骨细胞

［修回日期］2015-01-26

Transcriptional factor c-Jun regulates Mepe gene expression in osteoblasts

ZHANG Juan-juan，LIU Zong-xia，SUN Yan
(Institute of Stomatology，School of Dental Medicine，Weifang Medical University，Weifang 261053，China.E-mail: yansw2005 @ aliyun.com)

［ABSTRACT］AIM: To study the relationship between transcriptional factor c-Jun and Mepe gene expression，and to identify the specific binding site of c-Jun on the promoter of Mepe.METHODS: The expression of c-Jun and Mepe in mouse bone tissue was detected by immunolocalization assay.The mRNA expression of Mepe was determined by real-time PCR when the expression of c-Jun was changed.The techniques of dual luciferase analysis and site-specific mutagenesis were used to measure the effects of c-Jun on the transcriptional activity of Mepe.RESULTS: c-Jun was detected in the nucleus of osteocytes，while Mepe was observed in osteocyte cytoplasm.The results of real-time PCR showed that overexpression of c-Jun directly resulted in significantly higher up-regulation of Mepe mRNA.Compared with control group，the transcriptional activity of Mepe promoter was increased in osteoblasts which was transfected with pCMV-3Tag-1-c-Jun.Mutation of c-Jun potential binding sites decreased the transcriptional activity of Mepe promoter.CONCLUSION: Mepe gene transcription can be up-regulated by c-Jun which binds to the specific sites of Mepe promoter in osteoblasts.

［KEY WORDS］Transcription factor c-Jun; Matrix extracellular phosphoglycoprotein; Osteoblasts

2000年，Rowe等［1］对大鼠骨相关肿瘤基因进行筛选时，发现了一个明显差异表达的新基因，即细胞外基质磷酸化糖蛋白(matrix extracellular phosphoglycoprotein，Mepe)。Mepe蛋白主要在矿化的成骨细胞中表达，与骨骼及牙的形成和发育密切相关，同时也是调节体内磷酸盐平衡的重要生物分子［2］。随着研究的深入，发现Mepe在成骨细胞分化与骨发育再生、牙髓干细胞增殖分化、参与细胞DNA损伤应答、凋亡调节及肿瘤的发生中发挥着重要的作用，逐渐成为研究热点。

激活剂蛋白-1(activator protein-1，AP-1)是一类立早基因编码的核转录因子，其组成成员包括c-Fos家族的c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2与c-Jun家族的c-Jun、JunB、JunD，它们是成骨细胞、成软骨细胞和牙源性细胞株所必须的转录因子。c-Jun在细胞的正常生长、癌性转化和细胞凋亡过程中起着重要作用［3］。本研究通过观察c-Jun对Mepe基因启动子转录活性的影响，为进一步研究AP-1家族调控成骨细胞发育及骨相关疾病的发生奠定基础。

材料和方法

1动物

成年昆明小鼠，雌雄不限，40～50 g，由潍坊医学院实验动物中心提供;小鼠MC3T3-E1成骨细胞系由本实验室保存。

2主要试剂

兔抗鼠c-Jun和Mepe多克隆抗体(Abcam) ;鼠ABC免疫组化检测试剂盒(vector) ; DAB显色试剂盒(北京中山金桥) ;小量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒和基因组DNA抽提试剂盒(上海生物工程有限公司) ; pMD18-T Simple Vector、T4 DNA Ligase、Prime STAR HS DNA Polymerase、RNAiso Plus、Prime-ScriptRT reagent Kit、MutanBEST Kit(TaKaRa) ; HindⅢ、Xho I、EcoRⅡ、XhoⅡ限制性内切酶、Trans-FastTMTransfection Reagent和Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测试剂盒(Promega) ;α-MEM培养基和胰蛋白酶(HyClone) ;胎牛血清(杭州四季青公司) ;引物合成及测序由TaKaRa完成。

3主要方法

3.1免疫组化法检测c-Jun和Mepe在小鼠下颌骨中的表达取出生后5 d的小鼠脱颈处死，分离下颌骨，立即置于4%的中性甲醛溶液中4℃固定16 h，经10% EDTA(pH 8.0)溶液4℃脱矿7 d，常规制作石蜡切片。组织切片常规脱蜡入水，0.01 mol/L柠檬酸钠(pH 6.0) 95℃处理40 min抗原修复，3% H2O2/甲醇去除内源性过氧化物酶活性; 1∶50羊血清37℃、30 min封闭非特异结合蛋白，滴加1∶20的兔抗鼠c-Jun或MepeⅠ抗，4℃孵育过夜;滴加1∶200 HRP标记的羊抗兔抗体室温结合2 h;加AB液，37℃孵育30 min，DAB显色，常规封片，阴性对照组以PBS代替Ⅰ抗，显微镜下观察结果并拍照。以细胞深染成颗粒状棕黄色为阳性表达。

3.3 Real-time PCR检测过量表达和RNA干扰c-jun 对Mepe mRNA表达的影响根据Ambion提供的在线设计软件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)设计用于干扰c-jun表达的siRNA-c-Jun，其正义链为5’-CAGAGCAUGACCUUGAACCTT-3’，反义链为5’-GGUUCAAGGUCAUGCUCUGTT-3’，由TaKaRa合成。用含10%胎牛血清的α-MEM培养基培养小鼠成骨细胞传至5代以上，细胞计数达2×109cells/L时铺6孔板，细胞丰度为70%～80%时进行瞬时转染，操作步骤参照TransFastTMTransfection Reagent说明书进行。实验组转染100 ng pCMV-3Tag-1-c-Jun或siRNA-c-Jun，对照组转染100ng pCMV-3Tag-1或siRNA-control，过表达组转染24 h，RNA干扰组转染36 h后提取总RNA，逆转录为cDNA，进行RT-PCR检测c-Jun和Mepe mRNA表达的变化(引物序列见表1)。反应条件为94℃4 min;94℃10 s，60℃15 s，72℃25 s，80℃15 s，40个循环;72℃5 min。每个样本设3个复孔，重复3次。Ct值由IQ5TMPCR仪自动读出，结果进行2－ΔΔ Ct分析。

表1　引物序列Table 1.The sequences of the primers

3.4双萤光素酶报告基因检测系统检测c-Jun过表达对不同长度Mepe基因启动子的转录活性影响成骨细胞按6×107/m2接种于24孔板，继续培养24 h后用于瞬时转染。用50 ng重组质粒pCMV-3Tag-1-c-Jun转染小鼠成骨细胞，以pCMV-3Tag-1作为阴性对照，pRL-TK作为内参照。本实验共分5组，每组3个复孔。每组分别加入不同长度Mepe基因启动子重组质粒pGL3-Mepe-P-121-+ 23 (144 bp)、pGL3-Mepe-P-183-+ 23(206 bp)、pGL3-Mepe-P-343-+ 23 (366 bp)、pGL3-Mepe-P-543-+ 23 (566 bp)、pGL3-Mepe-P-1124-+23(1 147 bp)各300 ng(由本实验室保存)。转染后无血清培养基培养1 h后，补加含有胎牛血清的培养液至500 μL继续转染30 h后收板，进行萤光素酶活性检测。参照Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统(Promega)说明书进行检测: PBS洗涤细胞后，每孔加入100 μL PLB裂解15 min，取20 μL细胞裂解液加入50 μL LARⅡ混匀后立即检测萤火虫萤光素酶(firefly luciferase)发光的数值(U1)。之后加入50 μL Stop＆GloTM试剂混匀，立即检测海肾萤光素酶(Renilla luciferase)发光的数值(U2)。样品U1/U2之值即为报告基因的萤光素酶相对活性，每个样品的3组数据取平均值后进行统计学分析。

3.5 Mepe基因启动子上c-Jun结合位点的定点突变及其突变体的构建利用生物信息工具，对Mepe基因上游启动子序列－3 126/+ 198区域进行调控元件和转录因子结合位点分析，发现c-Jun的2个潜在结合位点。设计定点突变引物(表1)，由TaKaRa合成，以实验室的重组质粒pMD18-T Simple-Mepe-566为模板，按照TaKaRa MutanBEST Kit说明书进行定点突变，获得突变体pMD18-T Simple-Mepe-566mut。用Xho I和HindⅢ双酶切后再亚克隆到pGL3-Basic载体中，并送TaKaRa公司测序鉴定。构建成功的萤光素酶表达载体突变体命名为pGL3-Mepe-566mut1、pGL3-Mepe-566mut2和pGL3-Mepe-566mut(2个位点均突变)，同时将野生型PGL3-Mepe-566命名为PGL3-Mepe-566WT。

3.6萤光素酶报告基因检测系统检测转录因子c-Jun过表达时对野生型和突变型Mepe基因启动子转录活性的影响将重组质粒pCMV-3Tag-1-c-Jun瞬时转染小鼠成骨细胞，空质粒pCMV-3Tag-1作为阴性对照，pRL40质粒作为内参照，将实验分为5组: Basic组:300 ng pGL3-Basic+200 ng pCMV-3Tag-1-c-Jun或200 ng pCMV-3Tag-1; WT组:300 ng pGL3-Mepe-566WT+200 ng pCMV-3Tag-1-c-Jun或200 ng pCMV-3Tag-1; Mut1组: 300 ng pGL3-Mepe-566mut1+ 200 ng pCMV-3Tag-1-c-Jun或200 ng pCMV-3Tag-1; Mut2组:300 ng pGL3-Mepe-566mut2+200 ng pCMV-3Tag-1-c-Jun或200 ng pCMV-3Tag-1; Mut组: 300 ng pGL3-Mepe-566mut+ 200 ng pCMV-3Tag-1-c-Jun或200 ng pCMV-3Tag-1。每组3个复孔，相同条件下重复3次，用双萤光素酶报告基因检测试剂盒检测萤光素酶活性。

4统计学处理

实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示。采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，对RT-PCR结果用配对t检验进行比较分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 c-Jun与Mepe在小鼠下颌骨中的表达

免疫组织化学结果显示，作为转录因子的c-Jun在出生后5 d小鼠颌骨的成骨细胞胞核中呈阳性表达，同时还发现在成釉细胞的胞核中也呈阳性表达，Mepe在小鼠成骨细胞的胞浆中有表达，尤其在嵌入骨陷窝中的钙化骨细胞内表达量高，以PBS代替Ⅰ抗的对照组呈阴性，见图1。

Figure 1.The expression of c-Jun and Mepe in the mouse jawbone detected by immunohistochemistry.A: c-Jun was detected in the nucleus of osteocytes (×200) ; B: Mepe was observed in osteocyte cytoplasm (×400).图1免疫组织化学染色显示c-Jun和Mepe在小鼠颌骨中的表达

2小鼠c-jun基因的克隆及重组质粒pCMV-3Tag-1-c-Jun的构建及鉴定

小鼠c-jun基因PCR扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳显示，扩增的条带大小与目的片段大小一致(1 005 bp) ;重组质粒pCMV-3Tag-1-c-Jun经EcoRⅡ和XhoⅡ分别单酶切鉴定，得到大小分别为248 bp、4 957 bp与555 bp、4 650 bp的条带，与预测结果一致，见图2;初步鉴定正确的重组质粒pCMV-3Tag-1-c-Jun由TaKaRa公司测序分析，并进行Blast比对，结果显示所得基因序列与GenBank中小鼠c-jun基因序列完全一致，无碱基的点突变及移码发生。

3 c-jun的RNA干扰及过表达对Mepe基因表达的影响

成骨细胞中转染c-Jun siRNA 36 h后，real-time PCR检测结果表明，c-Jun mRNA表达水平下降约80%，差异显著(P＜0.05)，说明沉默效果较好。Mepe mRNA在c-Jun siRNA组表达水平下降约75%，而在转染过表达载体pCMV-3Tag-1-c-Jun组表达水平上升约5倍，差异显著(P＜0.05)，这表明转录因子c-Jun在调控小鼠Mepe转录过程中发挥作用，见图3。

Figure 2.Gene clone of c-jun and construction of overexpression vector pCMV-3Tag-1-c-Jun.A: the PCR result of c-Jun; B: enzyme digestion identification of recombinant plasmid pCMV-3Tag-1-c-Jun.1: the plasmid pCMV-3Tag-1-c-Jun digested by XhoⅡ(4 650 bp and 555 bp fragments) ; 2: the plasmid pCMV-3Tag-1-c-Jun digested by EcoRⅡ(4 957 bp and 248 bp fragments) ; 3: the plasmid pCMV-3Tag-1-c-Jun without digestion.图2 c-jun基因的克隆及过表达载体pCMV-3Tag-1-c-Jun的构建

Figure 3.The mRNA expression of c-Jun and Mepe detected by real-time PCR.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control siRNA group;#P＜0.05 vs pCMV-3Tag-1 group.图3 Real-time PCR检测c-Jun和Mepe mRNA的表达变化

4 c-Jun对不同长度小鼠Mepe基因启动子转录活性的影响

将转录因子c-Jun过表达载体pCMV-3Tag-1-c-Jun与不同长度的Mepe基因启动子pGL3-Mepe共转染30 h后，收集细胞检测萤光素酶活性。结果显示过表达c-Jun明显上调Mepe启动子的萤光素酶活性(P＜0.05)，并且对pGL3-Mepe-144与pGL3-Mepe-566上调幅度均较大(P＜0.05)，两者之间差异无显著性(P＞0.05)。由此推断Mepe启动子－121～+23与－543～－343区域存在c-Jun的特异性结合位点，可上调Mepe的转录，见图4。

5 Mepe基因启动子特征性序列定点突变体的构建及鉴定

通过转录因子结合位点分析找到Mepe基因启动子－105/－99与－491/－486区域存在潜在的2 个c-Jun结合位点(图5A)。根据设计的基因突变引物，以pMD18-T Simple-Mepe-566为模板，将特征性序列1的ACTGAGT突变为ACTTCGT，特征性序列2 的ACTCAC突变为ACGTAC，构建Mepe基因突变体真核表达载体pGL3-Mepe-566mut1、pGL3-Mepe-566mut2和pGL3－Mepe-566mut(2个位点均突变)。突变体质粒经酶切鉴定正确，由TaKaRa公司序列分析，并进行BLAST比对，结果显示Mepe基因启动子在预期位点发生突变，见图5。

6 c-Jun对野生型和突变型Mepe基因启动子转录活性的影响

双萤光素酶检测结果显示:转染过表达载体c-Jun后，pGL3-Mepe-566WT的萤光素酶活性上升约2 倍(P＜0.05)，pGL3-Mepe-566mut1与pGL3-Mepe-566mut2的萤光素酶活性上升约1倍(P＜0.05)，pGL3-Mepe-566mut的荧萤素酶活性无显著变化(P＞0.05)，与pGL3-Mepe-566WT相比较pGL3-Mepe-566mut1与pGL3-Mepe-566mut2的萤光素酶活性均下降了约40% (P＜0.05)，而pGL3-Mepe-566mut的萤光素酶活性下降了约75% (P＜0.05)，这证明了转录因子c-Jun可通过与Mepe基因启动子的特征性序列ACTGAGT与ACTCAC这2个结合位点相互作用，调控Mepe基因的表达，见图6。

Figure 4.The change of Mepe promoter relative luciferase activities after transfected with pCMV-3Tag-1-c-Jun.Mean ±SD.n=9.*P＜0.05 vs pCMV-3Tag-1 group.图4成骨细胞转染pCMV-3Tag-1-c-Jun对不同长度Mepe基因启动子萤光素酶活性的影响

Figure 5.The schematic diagram for two potential c-Jun-binding sites in Mepe promoter (A) and the results of sequencing identification for recombinant plasmid pGL3-Mepe-566mut1 (B) and pGL3-Mepe-566mut2 (C).图5 Mepe基因启动子上潜在的2个c-Jun结合位点示意图及重组质粒pGL3-Mepe-566mut1和pGL3-Mepe-566mut2的测序鉴定结果

讨论

Mepe是短整联蛋白黏合性配体互动糖蛋白(small integrin-binding ligand N-linked glycolproteins，SIBLINGs)蛋白家族的新成员，又名成骨细胞/骨细胞因子45(osteoblast/osteocyte factor 45，OF45)或osteoregulin，主要表达于骨组织、牙齿组织及肾近球小管中，与体内钙磷平衡及牙体硬组织的形成矿化密切相关［4-6］。小鼠Mepe基因与人类此基因在蛋白水平上具有44%的同一性和54%的相似性，都含有信号肽、RGD元件、SGDG元件以及ASARM元件;二者cDNA序列具有74%～79%的同一性。Mepe蛋白调节钙磷酸盐代谢功能以及成骨细胞的分化方面具有双重性［7］。最近的研究表明Mepe中不同的结构域对矿化起不同的作用，ASARM片段可以抑制钙化，而AC100片段则促进钙化［8-9］。Mepe过表达小鼠表现为骨形成和矿化减少，但是破骨细胞数目和活性却是降低的。Nagel等［10］在体外实验中观察到Mepe 和AC-100均能有效促进前成骨细胞的合成代谢，从而刺激骨髓基质细胞的增殖和分化。

原癌基因c-jun和c-fos是AP-1家族成员，其蛋白编码产物能通过亮氨酸拉链形成同源二聚体或异源二聚体，与许多基因的启动子上AP-1特征性序列结合，参与基因转录的调控，影响细胞的增殖和凋亡［11-12］。已知的受AP-1调控的骨特异性基因有骨钙素、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶等。c-Jun和c-Fos直接影响着成骨细胞和破骨细胞的分化、成熟和功能稳定［13-14］。研究证实c-Fos不表达或过表达均可导致骨发育异常［15］，提示c-Fos在骨形成和调控成骨细胞特异基因的表达中具有重要作用。c-jun编码产物为核内F78结合蛋白，是调节成骨细胞增殖分化的基因之一，在成骨细胞增殖期高度表达，分化期低表达或无表达［16］。

目前关于c-Jun和Mepe的关系目前还尚不明确，故本实验对成骨细胞中c-Jun在Mepe基因表达、转录调控中的作用进行了研究。本实验首先通过免疫组化的方法观察到小鼠成骨细胞胞核中有c-Jun的表达，Mepe在小鼠成骨细胞的胞浆中有表达，尤其在嵌入骨陷窝中的钙化骨细胞内表达量高，这为进行下一步深入的研究提供了依据。通过过量表达和基因沉默c-jun的表达后发现，Mepe的mRNA表达随c-Jun表达量的变化而变化，这表明c-Jun很可能参与了调控Mepe在成骨细胞中的表达，并且具有能够上调Mepe基因表达的重要作用。共转染c-Jun过表达载体pCMV-3Tag-1-c-Jun与不同长度的Mepe基因启动子后，通过萤光素酶活性检测发现过表达c-Jun明显上调Mepe启动子的萤光素酶活性，并且对Mepe启动子144 bp与566 bp上调幅度均较大。进一步通过对Mepe启动子近端区域进行转录因子结合位点分析显示，在－105/－99与－491/－486区域存在2个可能的c-Jun结合位点，对这2个位点进行定点突变发现，这2个潜在的c-Jun结合位点的单个或同时突变均能显著能降低Mepe启动子的转录活性，这表明c-Jun可能是通过直接与特异性结合位点ACTGAGT与ACTCAC结合来调控Mepe基因的转录。

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通讯作者△Tel: 0536-8462451; E-mail: yansw2005@ aliyun.com

*［基金项目］山东省自然科学基金资助项目(No.ZR2012HQ036) ;山东省自然科学基金资助项目(No.ZR2013HQ019) ;山东省高等学校科技计划项目(No.J12LL51)

［收稿日期］2014-12-09

［文章编号］1000-4718(2015)06-1026-06

［中图分类号］R336

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.011