三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞的保护机制及HSP70表达影响的研究△

李庆云（广州市第一人民医院老年病科　广州　510180）

三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞的保护机制及HSP70表达影响的研究△

李庆云（广州市第一人民医院老年病科广州510180）

目的：探讨三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞的保护机制及HSP70表达的影响。方法：选择刚出生的SD大鼠作心肌细胞原代培养及缺氧/复氧模型。将原代培养大鼠心肌细胞分为5组，A组为对照组；B组为缺氧/复氧对照组；C组为三七二醇低浓度组，D组为三七二醇中浓度组，E组为三七二醇高浓度组。用免疫组织化学法检测HSP70的表达，用生化比色法检测LDH活力。结果：三七二醇对SD大鼠缺氧/复氧心肌细胞具有明显保护作用，保护作用与三七二醇浓度有关。随着三七二醇浓度增加，缺氧/复氧心肌细胞HSP70表达增加，同时随时间延长，SD大鼠缺氧/复氧损伤心肌细胞内HSP70表达增加。结论：三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞保护作用可能与HSP70表达增加有关。不同浓度的三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞的保护均起一定作用。

三七二醇 缺氧/复氧 心肌细胞 热休克蛋白70

三七二醇具有降低脑血管阻力，增加颈内动脉血流量，抑制ADP、AA、PAF和凝血酶诱导的人体血小板聚集，降低血黏度和抑制血栓形成，改善微循环，改善脑缺血、脑梗塞引起的功能和行为障碍的功效。HSP70是热休克蛋白中的一种，可被多种刺激诱导，它与心肌缺血/再灌注损伤的关系密切，被广泛应用于心肌缺血再灌注损伤内源性保护机制的研究。本研究选择刚出生SD大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型，观察三七二醇对其保护作用及HSP70表达的影响。

1　材料和方法

1.1主要材料：选择刚出生1～3d的SD大鼠乳鼠，雌雄不限。不同浓度的三七二醇皂苷。

1.2方法：原代心肌细胞培养：用改良Harary［1］方法制备乳鼠心肌细胞，进行原代培养，3d后用0.25%胰酶消化用于传代。将盖玻片置于6孔培养板内，接种1×105/孔，作细胞爬片。隔天换含20%无血清低糖的DMEM培养液，3d后用于实验。

1.3心肌细胞模型的建立方法：正常对照组（C组）细胞不经任何处理，持续培养50h。心肌细胞缺氧/复氧模型的制备主要参照Webester［2］方法进行。预先培养1h；去掉培养液，加入预先用N2饱和的D-Hankcs液，置于无菌密闭容器，在恒温水浴箱内保持37℃，进气口通入95%N2+5%CO2混合气体，经出气口流出，使容器内保持无氧状态2h；将D-Hankcs液换成含20%无血清低糖的DMEM培养液，将细胞放回37℃，5%CO2培养箱复氧，继续培养48h。

1.4实验分组：将原代培养大鼠心肌细胞分为5组，A组为对照组；B组为缺氧/复氧对照组；C组为三七二醇低浓度组，D组为三七二醇中浓度组，E组为三七二醇高浓度组。用免疫组织化学法检测HSP70的表达，用生化比色法检测LDH活力。

1.5统计学方法：使用SPSS11.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，根据实验要求进行方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞LDH漏出的影响见表1。

表1　三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞LDH漏出的影响（±s）

表1　三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞LDH漏出的影响（±s）

组别　例数　LDH活力A B C D E 20 20 20 20 20 689.3±43.3 734.2±74.4*713.4±29.8☉634.5±57.7☉647.4±52.3☉

与I组比较，*P＜0.05；与II组比较，☉P＜0.05。

三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞LDH漏出的影响与A组相比，心肌细胞在缺氧/复氧后LDH释放明显增加（P＜0.05），表明心肌细胞受到缺氧/复氧损伤。加入不同浓度的三七二醇后，心肌细胞缺氧/复氧损伤得到不同程度减轻，与B组相比C、D、E 组LDH释放显著减少（P＜0.05），高浓度三七二醇比低浓度三七二醇保护作用强。

2.2三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞HSP70表达的影响：用显微镜观察，不难看出正常心肌细胞HSP70表达量非常少，有的几乎不表达；但缺氧/复氧损伤一旦发生，心肌细胞中HSP70表达增多（主要在胞浆内表达）。不同的缺氧/复氧时间，HSP70表达不同，缺氧/复氧0h，细胞中HSP70表达很少，几乎不表达。缺氧/复氧2h、4h、12h、24h，与A、B组相比，可见细胞中HSP70明增多。

3　讨论

热休克蛋白70（HSP70）具有促进细胞增殖、抗氧化损伤、分子伴侣［3］、细胞调节、ATP酶作用及参与细胞骨架的形成与修复等功能，尤其值得关注的是其具有的心肌保护作用和参与心肌细胞凋亡的调控［4］，能缩小心肌缺血坏死范围、保护心肌收缩力、抗心律失常［5］。本研究发现三七二醇对SD大鼠缺氧/复氧心肌细胞具有明显保护作用，保护作用与三七二醇浓度有关。随着三七二醇浓度增加，缺氧/复氧心肌细胞HSP70表达增加，同时随时间延长，SD大鼠缺氧/复氧损伤心肌细胞内HSP70表达增加。不同浓度的三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞的保护均起一定作用。

［1］Harary I，Barbara F.In vitrostudies of single isolated beatingheart cells［J］.Science，1960，31：1674-1657.

［2］Webester KW，Discher DJ，Bishopric NH.Cardioprotection in anin citro model of hypocic preconditioning［J］.J Mol Cell Cardiol，1995，27：453-458.

［3］Knowlton AA.The role of heat shock proteins in the heart［J］.Jmol Cell Cardiol，1995，27（1）：121-131.

［4］Suzuki k，Sawa Y，Kagisaki K，et al.Reductioninmyocardialapoptosis associated with overexpression of heat protein 70［J］. Basic Res Cardiol，2000，95：397-403.

［5］Gusarova V，Cap lan AJ，Brodsky JL，et al.Apoprotein B degradation is promoted by the molecularchaperonesHSP90andHSP70［J］.BiolChem，2001，276（27）：24891-24897.

△本文章是结题论文，项目编号：20121A011016。

R542.2+2

B

1672-8351（2016）02-0135-01