基于磁微粒化学发光法的肝纤四项检测限与功能灵敏度研究

王新灵　李忠信　关　学　渠　海

基于磁微粒化学发光法的肝纤四项检测限与功能灵敏度研究

王新灵1李忠信2★关学2渠海2

［摘要］目的评价磁微粒化学发光法检测肝纤维化血清学标志物（透明质酸、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原N端肽、Ⅳ型胶原）的空白限、检出限和功能灵敏度。方法参照美国临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）文件，利用空白样品及系列梯度稀释样品在AutoLumo A2000全自动化学发光测定系统上进行检测，确定该方法配套试剂的空白限、检出限及功能灵敏度。结果透明质酸的空白限为7．59 ng／mL，检出限为16．17 ng／mL，20%变异系数（coefficient of variation，CV）功能灵敏度为18．72 ng／mL；层粘连蛋白的空白限为1．38 ng／mL，检出限为3．53 ng／mL，20%CV功能灵敏度为4．16 ng／mL；Ⅲ型前胶原N端肽的空白限为0．89 ng／mL，检出限为2．40 ng／mL，20%CV功能灵敏度为2．48 ng／mL；Ⅳ型胶原的空白限为2．42 ng／mL，检出限为6．49 ng／mL，20%CV功能灵敏度为9．21 ng／mL。结论AutoLumo A2000全自动化学发光测定仪肝纤四项的空白限、检出限和功能灵敏度的建立为临床诊断和治疗提供了更有价值的信息。

［关键词］血清学；肝纤维化；磁微粒化学发光法；空白限；检出限；功能灵敏度

作者单位：1．河南中医学院药学院，河南，郑州450046 2．郑州安图生物工程股份有限公司，河南，郑州450016

Research on magnetism particulate immuno chemistry luminescence method for limit of detection and functional sensitivity of four items of liver fibrosis

WANG Xinling1, LI Zhongxin2★, GUAN Xue2, QU Hai2
(1. School of Pharmacy, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou, Henan, China, 450046; 2. Zhengzhou Autobio Biological Engineering Co.Ltd, Zhengzhou, Henan,China, 450016)

[ABSTRACT] Objective To evaluate the limit of blank(LoB), limit of detection(LoD) and functional sensitivity(F.S) of serum items for liver fibrosis[hyaluronic acid(HA), laminin(LN), procollagen type III N-terminal Propeptide(PIIINP), collagen type IV(CIV)] by magnetism particulate immuno chemistry luminescence method.MethodsThe LoB, LoD and F.S were confirmed by using the blank samples and series gradient dilution samples on AutoLumo A2000 in accordance with the files of clinical and laboratory standards institute (CLSI).Results The LoB of HA, LN, PIIINP, and CIV were 7.59 ng/mL, 1.38 ng/mL, 0.89 ng/mL and 2.42 ng/mL, respectively. The LoD of HA, LN, PIIINP, and CIV were 16.17 ng/mL, 3.53 ng/mL, 2.40 ng/mL and 6.49 ng/mL, respectively. The 20% CV F.S of HA, LN, PIIINP, and CIV were 18.72 ng/mL, 4.16 ng/mL, 2.48 ng/mL and 9.21 ng/mL, respectively. Conclusion More valuable informations for clinical diagnosis and treatment were provided by cofirming the LoB, LoD and F.S of the four liver fibrosis serum items on AutoLumo A2000.

[KEY WORDS]Serology; Liver fibrosis; Magnetism particulate immuno chemistry luminescence method; Limit of blank (LoB); Limit of detection (LoD); Functional sensitivity (F.S)

肝纤维化是紧随肝细胞破坏之后的自身修复过程，是慢性肝病发展为肝硬化的必经之路，其实质是细胞外基质合成与降解失衡，导致细胞外基质尤其是胶原在肝内的过度增加和沉积［1-2］。肝纤维化血清学四项指标是目前最为常用的检测肝纤维化的血清学指标，包括透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层粘连蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前胶原N端肽（procollagen typeⅢN-terminal propeptide，PIIINP）和Ⅳ型胶原（collagen type IV，CIV）。随着免疫学检测的发展，化学发光法特别是全自动化学发光法已经广泛应用于血清学标志物的检测。本实验室利用国产全自动化学发光免疫分析仪，根据《医学实验室质量和能力认可准则CNAS-CL 02：2012／ISO 15189：2012》、《医学实验室质量和能力认可准则在临床免疫学检验领域的应用说明CNAS-CL39》，采用美国临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的相关文件介绍的方法，对肝纤四项磁微粒化学发光法检测试剂的空白限（limit of blank，LoB）、检出限（limit of detection，LoD）、功能灵敏度（functional sensitivity，F．S）等性能指标进行研究，现报道如下。

1　材料和方法

1．1材料

1．1．1仪器与试剂

郑州安图生物工程股份有限公司生产的全自动化学发光测定仪AutoLumo A2000及其配套肝纤维化检测试剂（试剂批号：HA：20140124；LN：20140108；PIIINP：20140321；CIV：20140312）；安图公司通用稀释液（批号：2014040101）及2水平质控品（批号：HA：20131201；LN：20140114；PIIINP：20131119；CIV：20130910）。按说明书要求保存。

1．1．2临床样本收集

收集郑州市第六人民医院健康男性体检低值新鲜血清20例（要求无任何可见疾病症状的健康人，酒精肝、脂肪肝、药物肝、各种肝损害应当排除），年龄18岁～22岁，平均19．7岁，于37℃下温育30 min后，置于离心机以4 000 rpm离心10 min，分离血清，混合备用。

1．2方法

1．2．1检测仪器的维护与质量控制

每天实验前后均对仪器进行维护保养，严格按照说明书要求进行操作，并执行定期校准。利用各项目质控品进行实验前的室内质控，失控发生时测定的样本数据不采用。

1．2．2确定LoB的程序

按照CLSI EP17-A文件进行［3］。利用通用稀释液做空白样品，每个项目每天检测2批，间隔不小于2 h，每批6个重复，共进行5 d，记录检测浓度值，每个项目分别获得60个结果。按ISO推荐在规定水平的Ⅰ类错误下，设定α＝5%，即LoB有5%的可能性含有待测物。采用非参数检验，将空白样品的结果由小到大排序，第95百分位数值即为LoB。

1．2．3梯度样品制备

混合均匀后的健康人体检血清分别进行4个指标的测定，每个指标3个重复，记录检测结果，并计算各指标平均浓度值；根据LoB结果，利用通用稀释液对混合血清按照测定的平均值进行系列稀释，样品的浓度范围在LoB的1倍～4倍之间，每个指标各稀释5个梯度，用来确定LoD、F．S。

1．2．4确定LoD的程序

按照CLSI EP17-A文件进行［3］。对每个项目的系列稀释样本进行相应指标检测，每天各检测2批，间隔不小于2 h，每个指标2个重复，共进行5 d，记录检测浓度值，每个项目分别获得100个结果，将结果从小到大排列。为了强调Ⅱ类错误，设定β＝5%，即LoD有5%的可能性不含有待测物。采用非参数估计LoD，LoD＝LoB＋DS，β。DS，β是低浓度样品测定值中位数的值和低浓度样品的第5个百分位数值的间距。

1．2．5确定F．S的程序

功能灵敏度用于确定检测系统可报告的最低限值，以天间重复检测的变异系数（coefficient of variation，CV）为20%时对应LoD样品具有的平均浓度为该试剂的F．S。

2　结果

2．1 LoB结果

采用非参数检验，将空白样品的结果由小到大排序，第95百分位数值即为LoB。

公式：P（1－α）＝（1-α）%×NB＋0．5

其中：α为Ⅰ型错误，设定5%；P（1-α）为在（1-α）百分位数位置的值；NB为空白样本的重复检测次数。

根据以上公式，得出第95百分位数值为所有空白样本检测结果按从低到高顺序排列的第57．5位数值。表1为各项目空白样品检测结果排序后第51位～第60位的数值。计算各项目第57．5位的结果即为此项目的LoB，见表2。

表2　肝纤四项LoB结果（ng／mL）Table 2　The results of LoB of four items of liver fibrosis （ng／mL）

2．2混合血清原始结果

混合均匀后健康人体检血清肝纤四项检测结果见表3。

表3　混合血清肝纤四项原始结果（ng／mL）Table 3　The results of four items of liver fibrosis in pooled serum（ng／mL）

2．3系列稀释样品梯度选择

利用混合血清制备4个项目系列稀释样品的制备浓度见表4。

表4　肝纤四项系列稀释样品制备浓度（ng／mL）Table 4　The results of four items of liver fibrosis in series gradient dilution samples（ng／mL）

2．4 LoD结果

4个项目5个梯度样品测定的结果按由小到大排序，将第1位～第10位和第46位～第55位结果记录于表5中。根据公式LoD＝LoB＋DS，β。其中DS，β是中位数值和第5个百分位数值的间距。中位数值为第50．5位置结果，第5百分位数值为第5位置结果。DS，β＝第50．5位置结果－第5位置结果。故可计算出各项目LoD，见表6。

2．5 F．S结果

分别计算4个项目5个梯度样品测定结果的平均值、标准差和CV，结果如表7所示。按照天间重复检测的CV≤20%的要求，各项目天间CV最接近20%所对应的浓度值即为此项目的F．S。由表7可看出，HA浓度为18．72 ng／mL、LN浓度为4．16 ng／mL、PⅢNP浓度为2．48ng／mL、CⅣ浓度为9．21ng／mL时，天间CV最接近20%，故此浓度即为各项目的F．S。

3　讨论

肝纤维化不是一个独立的疾病，而是许多慢性肝病发展为肝硬化的共同病理过程，对肝纤维化的早发现、早治疗有着重要意义［4］。血清学检测由于其无创伤性，同时具有简单、方便、利于动态检测的优点，从而成为肝纤维化诊断的重要辅助手段［5］。近年来人们对肝纤维化研究的兴趣与日俱增，在诊断和治疗方面也取得一定的进展。姚真荣等利用化学发光法检测132例乙型病毒性肝炎患者血清中肝纤维化四项指标的水平，发现单个指标检测中，HA是四项指标中鉴别诊断肝炎与肝硬化最有价值的一项；通过HA联合其他指标进行分析，发现其中HA和PIIINP组合特异性、准确性最高［6］。目前国外学者对肝纤维化的检测与治疗方面研究较少，并且利用肝纤四项作为肝纤维化检测血清学标志物的研究更加稀少，仅是将其中的某一项或某几项作为检测标志物。Catanzaro等利用透明质酸、Ⅲ型前胶原肽、基质金属蛋白酶抑制剂Ⅰ型作为标志物与肝活检进行比对研究，建立起一种用于肝纤维化进程检测的非侵入性方法［7］；Zeuzem等研究了faldaprevir、deleobuvir、和ribavirin等药物在治疗慢性丙肝引起的晚期肝纤维化或肝硬化方面的疗效和安全性［8］。分析国外研究较少的原因，笔者认为可能与肝脏疾病在流行病学上主要集中在国内、肝纤四项在检测肝纤维化上缺乏组织特异性及医学伦理等方面相关。

表5　各项目梯度样品第1－10位和第46－55位结果（ng／mL）Table 5　The results of 1－10 and 46－55 in series gradient dilution samples（ng／mL）

表6　肝纤四项LoD结果（ng／mL）Table 6　The results of LoD of four items of liver fibrosis （ng／mL）

表7　肝纤四项梯度稀释样品检测CV统计结果Table 7　The results of CV of four items of liver fibrosis in series gradient dilution samples

医学实验室在使用某种检测系统或检验方法前均应对该系统或方法的分析性能进行评价，选择性能优良的检测系统或检验方法是保证病人检验结果真实、可靠的前提。随着全自动检测仪器的广泛使用，检验工作者更加重视完成一个检验项目所涉及的仪器、试剂等组成的检测系统的可靠性。戴悦等按美国病理家协会和ISO15189实验室认可的要求，对罗氏电化学发光系统促甲状腺激素受体抗体检测方法进行评价和性能验证，虽然各项指标均能满足临床要求，但提示评价结果与厂商提供的并不完全相同，建议各实验室应自主设立相应的分析性能指标［9］。在实际检验工作中，参考CLSI发布的方法学评价系列文件（EP05-A2、EP06-A、EP09-A2、EP15-A2、EP17-A等）对检测方法和检测系统进行性能评价已经成为趋势。目前检验工作者需要首先摆脱对相关性能指标定义不明确的现象。结合本文，LoB、LoD与F．S均是评价检测系统或方法的灵敏度性能，但与分析灵敏度容易混淆。张秀明等针对临床实验室、仪器和试剂生产厂商及检验医学期刊中不能正确理解和区别灵敏度和检出限的现象，对它们进行详细的分析比较，并给出正确使用的方法［10］。

国内外鲜有利用EP文件研究肝纤维化血清标志物检测试剂分析性能的相关报道，特别是对空白限、检出限和功能灵敏度的研究更加匮乏。目前国内研究较多的集中在肝纤维化血清学检测的方法建立上。张运洪等对肝纤四项化学发光试剂的精密度、加样针携带污染率、准确度、线性范围和参考区间进行验证，显示四项的批内变异均在5%以内，批间变异均在6%以内，准确性的偏差均不超过2%，携带污染、线性范围和参考区间均符合预期要求［11］。此研究虽利用EP文件进行性能指标评价，但并不涉及灵敏度各指标，同时其使用的是评价方法，而非建立方法。在实际应用中，建立方法虽然复杂，可客观性和有效性要优于评价方法。

随着EP文件的普及，利用此文件进行检测系统及方法的性能建立及评价已经成为生产商和检测实验室的首选，也必将成为性能评价方法的“金标准”。本文参考CLSI发布的EP文件，利用国产全自动化学发光检测系统，采用性能确认方法，对肝纤四项血清学标志物检测试剂的空白限、检出限和功能灵敏度进行了研究，结果显示各检测限值均低于厂家声明值，可在低值区样本的准确定量和稳定检测方面发挥更加重要的作用。

参考文献

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[10]张秀明，冯仁丰．正确理解和使用分析灵敏度及检出限［J］．中华检验医学杂志，2014，37（9）：669－672．

[11]张运洪，何玲，黄建军．化学发光免疫分析法检测肝纤维化血清标志物的性能评价［J］．检验医学与临床，2014，11（3）：304－309．

通讯作者：★李忠信，E-mail：lizhongxin＠autobio．com．cn

基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）（2011AA02A101）