基于飞行时间质谱技术对降解检材的插入缺失遗传多态性检验

冯 锐，周建波(.湖南省公安厅 刑侦总队，湖南长沙40000;.永州市公安局 刑侦支队，湖南永州45000)

基于飞行时间质谱技术对降解检材的插入缺失遗传多态性检验

冯 锐1，周建波2
(1.湖南省公安厅 刑侦总队，湖南长沙410000;2.永州市公安局 刑侦支队，湖南永州425000)

目的 通过采用飞行时间质谱技术对插入缺失遗传多态性遗传标记的检验，探讨该技术对降解检材的DNA分型策略。方法 提取切片DNA，在用STR试剂盒检测未能获得分型结果的情形下，采用多重PCR和飞行质谱技术对常染色体上的30个InDel位点进行分型检测。结果对于STR分型失败的切片，InDel分型获得成功。结论对于切片等微量、降解的生物学检材，若常染色体STR基因座分型失败，可尝试进行InDel位点的分型，以获得更多的遗传信息。

法医遗传学;插入缺失遗传多态性;飞行时间质谱

在法医学实践中，经常会遇到一些降解严重的生物学检材，普遍采用的STR检测试剂盒或MiniSTR检测试剂盒往往得不到理想的分型结果。这种情形下，选用其他遗传标记进行检测，往往能获得一定的信息量。本研究针对一起特殊的个体识别案件，采用飞行质谱分型技术成功地进行了插入缺失遗传多态性遗传标记(Insertion/Deletion polymorphism，InDel)检验。

1 材料与方法

1.1 样本

医院保存的石蜡包埋组织切片，编为1号;人体毛发，编为2号。

1.2 试剂与仪器

384微孔板(美国SEQUENOM公司);IdentifilerTM试剂盒(美国 AB公司);MinifilerTM试剂盒(美国 AB公司);9700型扩增仪(美国AB公司);3500XL型遗传分析仪(美国AB公司);芯片(MassARRAY SpectroCHIP，美国Sequenom公司);MALDI-TOF质谱仪(美国Sequenom公司)。

1.3 基因组DNA的提取

基因组DNA的制备采用Chelex-100法。

1.4 常染色体STR基因座分型

采用 IdentifilerTM试剂盒对常染色体上 15个STR基因座进行分型检测。PCR反应体系总体积为12.5 μL，PCR组分及反应条件参照说明书。

1.5 常染色体MiniSTR基因座分型

采用MinifilerTM试剂盒对常染色体上8个STR基因座进行分型检测。PCR反应体系总体积为12.5 μL，PCR组分及反应条件参照说明书。

1.6 InDel位点的选择

参照李成涛等［1］的文章，选定在常染色体上的30个InDel位点 (见表1)，PCR扩增体系的为15.0 μL，包括 MasterMix 7.5 μL，Q-solution 1.5 μL，PrimerMix 3.0 μL，模板DNA 3.0 μL。PCR扩增条件为:95℃11 min;94℃ 30 s，57℃ 90 s，72℃ 90 s，共30个循环;60℃延伸60 min。PCR反应在9700扩增仪上进行。PCR扩增结束后，用虾碱性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)酶进行酶切反应，反应程序为: 37℃40min;85℃5min。接着，进行单碱基延伸反应(体积为2 μL)，体系中含10×iPlex缓冲液0.2 μL，iPlex终止反应液0.1 μL，Plex酶0.02 μL，0.94 μL延伸引物。延伸反应程序为:94℃ 30 s;94℃ 5 s，(52℃5 s，80℃5 s)5次小循环，40次大循环;72℃3min。将产物用树脂纯化，转移至表面覆盖基质的芯片，用MALDI-TOF质谱仪检测，TYPER软件分析实验结果，获得分型数据。

表1 30个InDel位点信息

2 结果

2.1 常染色体STR基因座分型结果

提取切片的DNA后，采用IdentifilerTM试剂盒、MinifilerTM试剂盒对常染色体上的STR基因座进行检测，均未检见PCR产物。

2.2 InDel位点的分型结果

切片DNA经多重PCR体系的扩增，30个InDel位点均获得分型结果，与对照毛发比对发现，两者基因型一致。经计算，似然率为5.56×1024。

3 讨论

本案中切片组织是唯一的线索，对切片DNA遗传信息的获取对于案件的侦破具有重要意义。通过对切片DNA进行传统的STR检测，均未获得有效的分型结果，因此尝试采用新的技术如SNP分型或插入缺失分型也许能够获得较好效果。InDel作为一种特殊的二态性遗传标记，与SNP具有相近的突变率，其突变率显著低于STR。同时，InDel的两个等位基因表现为片段长度多态性，这又与STR等位基因的特征类似，因而成为法医DNA鉴定关注的热点［2］。

本实验参照李成涛课题组的研究成果，对切片DNA成功进行了30个InDel位点的检测，获得了有效的遗传信息，为本案侦破提供了重要线索。对于选择的这30个InDel位点，本实验采用了另外一种技术平台即飞行时间质谱。该技术源自美国Sequenom公司研发的SNP检测系统，判读SNP分型结果的方法简便易行［3-4］。在质谱图上，每一个SNP位点有3条线，对应3个质量的检测:第一条线对应的是未延伸引物(UEP);第二、三条线对应两个等位基因，哪条线出峰，就代表具有对应的等位基因;若均不出峰，表明为阴性结果。本研究的30个InDel位点扩增产物长度范围为88～128bp，比Minifiler试剂盒的扩增产物短，这也是能够分型成功的可能原因。该案例的分型成功，提示InDel对于STR、MiniSTR分型失败的微量、降解检材可能是一种有效的补充工具。

［1］Chengtao Li，Suhua Zhang，Shumin Zhao.Genetic analysis of 30 InDel markers for forensic use in five different Chinese populations［J］.Genet.Mol.Res，2011，10(2):964-979.

［2］Mills RE，Luttig CT，Larkins CE，et al.An initial map of insertion and deletion (INDEL)variation in the human genome［J］.Genome Res，2006，16(9):1182-1190.

［3］Hofstadler SA，Hall TA，Sannes-Lowery KA，et al.Analysis ofDNA forensic markers using high throughputmass spectrometry［J］.Forensic Sci Int.Genetics Supplement Series，2009，(2):524-526.

［4］Planz J，Budowle B，Hall T，et al.Enhancing resolution and statistical power by utilizing mass spectrometry for detection of SNPs within the short tandem repeats［J］.Forensic Sci Int. Genetics Supplement Series，2009，(32):529-531.

(本文编辑:李成涛)

InDeI Typing of Degraded DNA by Time-of-fIight Mass Spectrometry

FENG Rui1，ZHOU Jian-bo2
(1.Criminal Investigation Corps of Public Security Bureau of Hunan Provice，Changsha 410000，China; 2.Criminal Investigation Detachment of Yongzhou Public Security Bureau，Yongzhou 425000，China)

Objective The method for DNA typing of insertion/deletion polymorphism markers from degraded DNA was explored based on the technology of time-of-flight mass spectrometry.MethodGenomic DNA was prepared from slice samples，and multiplex PCR was carried out.When no typing results were obtained using STR kits，samples were further analyzed using 30 InDels by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF).ResuItsFull profiles of InDels loci were obtained.ConcIusionFor typing of DNA from trace or degraded biological samples，analysis of InDel markers by MALDI-TOF can provide more genetic information even when STR genotyping fails.

forensic genetics;insertion/deletion polymorphism;time-of-flight mass spectrometry

DF795.4

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2015.06.010

1671-2072-(2015)06-0057-03

2015-03-12

冯锐(1984-)男，法医师，主要从事法医物证学鉴定。E-mail:277038570@qq.com。