亲子鉴定中STR基因座来源不明突变的分析

兰菲菲， 丁红珂， 陈延冰， 余丽华， 尹爱华

（广东省妇幼保健院医学遗传中心，广东 广州 511442）

短串联重复序列（short tandem repeat，STR）基因座作为重要的人类遗传学标志，已被广泛应用于人类遗传学和法庭科学。近十几年来，使用多个STR基因座的复合扩增试剂盒获得个体的等位基因分型进行比对分析，是亲子鉴定重要的检测应用和研究方法之一。在实践应用中，STR基因座等位基因的突变现象在国内外均有报道[1-3]，由于等位基因的突变对亲权指数的正确计算、鉴定结论及亲子鉴定的科学性均有不同程度的影响，本研究对发现的2个突变来源不明家系的突变基因座进行了分析，确定突变来源并探讨突变基因座亲权指数的计算方法。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2016—2018年广东省妇幼保健院日常受理的4 385例亲子鉴定案件及司法部的亲子鉴定能力验证考核案例，研究家系为生母、孩子和被检父的三联体亲子鉴定或者父子/女、母子/女的二联体亲子鉴定。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取 家系的血液和血卡样本按照我国公安部发布的GA/T 383—2014《法庭科学DNA实验室检验规范》[4]附录A中的Chelex-100法常规提取基因组DNA。

1.2.2 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增 取DNA提取液1 μL，应用Powerplex 21体系（美国Promega公司）进行20个常染色体STR基因座的多重PCR扩增。

1.2.3STR基因座的等位基因分型 Powerplex 21体系包括D3S1358、D8S1179、D6S1043、Penta E、TPOX、D12S391等20个常染色体基因座，扩增片段范围在500 bp内。PCR扩增产物加入ILS500内标（包含在Powerplex 21体系试剂盒内）后应用3500XL基因分析仪（美国应用生物系统公司）进行毛细管电泳，标记每个STR基因座扩增片段的大小。按照Powerplex 21体系操作说明，将电泳数据与GeneMapper ID-X软件（美国应用生物系统公司）中预设的Powerplex 21体系提供的Ladder中每个STR基因座等位基因的片段大小进行比对，获得被检测样本STR基因座的等位基因分型。

1.3 突变来源的研究

1.3.1STR基因座突变的确定 2个家系应用Powerplex 21体系检测发现，孩子的基因座出现不符合遗传规律的现象，对不符合遗传规律的家系分别采用Microreader 23sp ID体系（苏州阅微基因技术有限公司）和Identifiler体系（美国应用生物系统公司）确定D12S391、D8S1179和TPOX基因座发生的突变。

1.3.2 突变STR基因座的测序 针对发生突变的STR基因座，查询UCSC数据库（http：//genome.ucsc.edu） 中基因座的序列信息，设计引物进行单基因座的PCR扩增，引物序列见表1。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃后延伸5 min。对PCR扩增后的产物进行测序分析。

表1 单基因座扩增引物

1.3.3 突变STR基因座的亲权指数计算 按照GB/T 37223—2018《亲权鉴定技术规范》[5]中三联体不符合遗传规律的亲权指数计算方法，计算突变STR基因座的亲权指数。

2 结果

2.1 STR基因座的突变情况

Powerplex 21体系检测结果显示有2个家系发生了STR基因座等位基因的突变。见表2。

经过Microreader 23sp ID体系和Identifiler体系的检测验证，发现2个家系发生了STR基因座等位基因突变，其中一个家系的突变发生在D12S391基因座，另一个家系的突变发生在TPOX基因座和D8S1179基因座。见表2、图1。3个基因座的突变来源均不能明确。

图1 D12S391、D8S1179和TPOX基因座等位基因分型图谱

表2 突变基因座在不同检测体系的等位基因分型结果

2.2 突变STR基因座的测序分析

对D12S391、TPOX单基因座扩增后的测序分析发现，2个家系中孩子在D12S391基因座和TPOX基因座的突变来源于母亲。D12S391基因座中，孩子的等位基因18由母亲的等位基因19突变而来，孩子的等位基因21来源于父亲。TPOX基因座中，孩子的等位基因10由母亲的等位基因11突变而来，孩子的等位基因8来源于父亲。见图2、图3。

图2 D12S391基因座突变等位基因的序列分析

图3 TPOX基因座中孩子等位基因10突变的序列分析

2.3 亲权指数计算

根据GB/T 37223—2018《亲权鉴定技术规范》[5]中三联体不符合遗传规律的亲权指数计算方法和测序结果分析确定的等位基因突变来源，计算3个突变STR基因座的亲权指数如下：D12S391亲权指数=X/Y=μm/（4p18）；TPOX亲权指数=X/Y=μm/（2p10）；D8S1179亲权指数=X/Y=μf/（4p17）；式中X为假设被检测个体遗传表型是孩子生物学父亲的概率，Y为假设随机个体遗传表型是孩子生物学父亲的概率，μm为女性突变率，μf为男性突变率。

3 讨论

亲子鉴定中STR基因座发生突变的现象比较常见，平均突变率为2‰[6]，主要发生机制是核心重复序列出现复制滑动或错配[7]。在亲子鉴定实践中遇到突变现象时，首先要确定突变的真实性，特别是遇到只有单峰的看似为“纯合子”，但峰高却与杂合子相近的等位基因分型时，考虑突变STR基因座是否存在等位基因丢失或其他异常现象。面对这种情况，可以选择应用不同检测试剂盒检测比对突变基因座的等位基因分型情况进行确定。在生母、孩子和被检父的三联体亲子鉴定中，是在母亲为生物学母亲的前提下，检测被检父是否为孩子的生物学父亲。如果被检父是孩子的生物学父亲，根据孟德尔遗传规律，孩子STR基因座的2个等位基因一个来自于母亲，另一个来自于被检父，可以在被检父的STR基因座中找到来源。如果在检测的多个STR基因座中遇到1个或2个不符合孟德尔遗传规律的情况，即孩子STR基因座中的1个等位基因无法在被检父的STR基因座中找到来源，那么考虑该STR基因座发生了父源性突变。根据突变情况计算该基因座的亲权指数，在亲子鉴定中父源性突变较为常见。但如果出现孩子个别STR基因座中的1个等位基因无法在生物学母亲的STR基因座中找到来源时，则考虑该STR基因座发生了母源性突变。有时还会出现孩子STR基因座难以确定突变来源即突变来源不明的情况。由于父源性突变与母源性突变在计算STR基因座的亲权指数时应用的突变系数和计算公式不同，所以可能会影响亲子鉴定的结论。本研究分析了在鉴定实践中遇到的2个家系的3个STR基因座不明突变的来源，涉及其父源性突变或母源性突变的确定及亲权指数计算。本研究对发现的突变基因座分别应用Microreader 23sp ID体系或Identifiler体系进行验证，发现与Powerplex 21体系检测到的等位基因分型一致。

本研究中D12S391基因座如果考虑父源性突变有2种情况：一步突变（孩子的等位基因18，21：21来自母亲，18由父亲的17突变而来）或三步突变（21来自母亲，18由父亲的21突变而来）；如果考虑母源性突变同样有2种情况：一步突变（孩子的等位基因18，21：21来自父亲，18由母亲的19突变而来）或三步突变（21来自父亲，18由母亲的21突变而来）。TPOX基因座如果考虑为母源性突变为一步突变（孩子的等位基因8，10：8来自父亲，10由母亲的11突变而来），考虑父源性突变则为两步突变（孩子的等位基因8，10：8来自母亲，10由父亲的8突变而来）。D8S1179基因座如果考虑为母源性突变为四步突变（孩子的等位基因15，17：15来自父亲，17由母亲的13突变而来），考虑父源性突变则为一步突变（孩子的等位基因15，17：15来自母亲，17由父亲的18突变而来）。逐步突变模式理论认为，90%的STR基因座突变为一步突变，且父系来源的突变率较母系来源的突变率高，约为3.5∶1[8-9]。如果按逐步突变理论进行推理，首先考虑突变步数绝大多数为一步突变，本研究中的TPOX基因座应考虑为母源性突变，D8S1179基因座应考虑为父源性突变，D12S391基因座父源性突变和母源性突变均有可能。单基因座扩增测序结果分析发现，D12S391基因座孩子等位基因18的突变来源于母亲，由母亲的等位基因19突变而来，为母源性一步突变，等位基因21来源于父亲。TPOX基因座孩子等位基因10的突变来源于母亲，由母亲的等位基因11突变而来，为母源性一步突变。D12S391和TPOX基因座均符合逐步突变模式理论。根据GB/T 37223—2018《亲权鉴定技术规范》[5]中三联体不符合遗传规律的亲权指数计算方法和测序结果分析确定的等位基因突变来源，计算3个突变STR基因座的亲权指数如下：D12S391亲权指数=X/Y=μm/（4p18）；TPOX亲权指数=X/Y=μm/（2p10）；D8S1179亲权指数=X/Y=μf/（4p17）。如果没有进行测序确定等位基因突变的来源，则可以考虑按照的逐步突变理论，首先考虑一步突变，D12S391基因座亲权指数=X/Y=（μf+μm）/4p18，TPOX和D8S1179基因座亲权指数的计算方式与上述相同。

STR基因座的等位基因突变现象较为常见，由于突变基因座的亲权指数计算对亲子鉴定的累积亲权指数（cumulative parental index，CPI）计算有较大影响，从而影响鉴定结论的科学性。尤其当0.000 1＜CPI＜10 000时，对于得出“肯定”或者“排除”的结论具有重要影响。因此，遇到突变时应首先验证突变的真实性，进而确定突变的来源，从而正确计算突变基因座的亲权指数，得出科学、正确的鉴定结论。