RP-HPLC同时测定维生素片中8种食用合成着色剂含量

汪明志 汪映宇 陈蓉 张超 张华锋 顾炳仁

（苏州市食品药品检验所 ，江苏 苏州 215104）

RP-HPLC同时测定维生素片中8种食用合成着色剂含量

汪明志 汪映宇 陈蓉 张超 张华锋 顾炳仁

（苏州市食品药品检验所 ，江苏 苏州 215104）

目的：建立反相高效液相色谱法同时测定维生素片中8种合成着色剂的方法。方法：色谱柱为C18柱（250 mm×4.6 mm，7μm)，流动相为甲醇-0.02 mol/L乙酸铵，梯度洗脱，检测波长为254 nm。结果：8种着色剂在0.050～1.037μg/m L范围内峰面积和浓度线性关系良好（r＞0.999），平均回收率为94.09%～100.34%。结论：该方法稳定，灵敏度高，方便，快速，可以作为检测维生素片中合成着色剂的方法。

反相高效液相色谱；食用合成着色剂；维生素片；含量

维生素是维持机体正常代谢和身体健康必不可少的重要物质，是构成多种辅酶和激素的重要成分，缺乏时可导致代谢障碍，引发多种疾病。维生素片含有多种维生素，可以预防和治疗维生素缺乏所引发的多种疾病。维生素片多为包衣片，包衣可以掩盖片剂不良气味、减少环境因素对产品稳定性的影响、增加适用性、美化外观等。随着市场的激烈竞争，为了吸引消费者，生产商在包衣材料中加入各种不同颜色的着色剂。着色剂有天然着色剂和合成着色剂之分，由于天然着色剂价格高，性质不稳定，而合成着色剂性质稳定，价格低廉，所以市场中片剂包衣所用着色剂多为合成着色剂。然而，人工合成着色剂多以化工产品为原料，经过一系列有机反应化合而成，含有一定的有害物质，影响人体正常新陈代谢、细胞活性、甚至引起癌变。所以，对维生素片包衣中合成着色剂进行研究和分析，对保障人民健康具有重要的意义。本实验采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）快速检测维生素包衣片中常见8种食用合成着色剂含量，为控制和监督维生素包衣片中合成着色剂使用提供一定的参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪，2996PDA检测器，真空泵，G3垂熔漏斗，恒温水浴锅，pH计。

1.2 材料

柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝（纯度分别为90.0%，87.0%，93.1%，70.0%，89.0%，88.0%，85.0%，91.0%，来源：Dr. Ehrenstorfer），聚酰胺粉（100目），甲醇（色谱纯），柠檬酸，甲酸，乙醇，氨水，乙酸均为分析纯，超纯水。样品：TCBJ多种维生素片、HJDD多种维生素片、FYD维生素片、KMS维生素片、ALD维生素片（均来自市场监督抽样）。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，7μm），检测波长：254 nm，柱温：35℃，流速：1.0 m L/min，进样量：10μL，流动相：甲醇（A）-0.02 mol/L乙酸铵（B），梯度洗脱，5 m in，A：5%，B：95%；5～10 m in，A：5%→15%，B：95%→85%；10～ 20 m in，A：15%→20%，B：85%→80%；20～ 25 m in，A：20%→65%，B：80%→35%；25～ 27 m in，A：65%，B：35%；27～ 32 m in，A：65%→95%，B：35%→5%。

2.2 标准溶液的制备

准确称取按其纯度折算成100%质量的柠檬黄22.36 mg，日落黄23.77 mg，苋菜红22.11 mg，胭脂红29.37 mg，新红23.03 mg，赤藓红22.90 mg，亮蓝24.00 mg，靛蓝22.80 mg，置20 m L容量瓶中，加pH值为 6的水到刻度，配成标准储备液备用。

2.3 供试品溶液的制备

取维生素包衣片适量，研细，取约10 g，精密称定，放入 100 m L小烧杯中，用水反复洗涤色素，到试样无色素为止，合并色素漂洗液为试样溶液。试样溶液加柠檬酸溶液调pH值到6，加热至60℃，将1 g聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入试液溶液中，搅拌片刻，以 G3垂熔漏斗抽滤，用60℃pH值为4的水洗涤3～ 5次，后用甲醇-甲酸混合溶液洗涤3～ 5次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5m L，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，转移至5 m L容量瓶中，定容至刻度，即得。

2.4 标准图谱的制备

精密吸取上述标准储备液5 m L于100 m L量瓶中，加水定容至刻度，精密吸取10μL进样，按“2.1”项下色谱条件进行分析测定，得到色谱图1。

图1 8种合成着色剂的标准品RP-HPLC图

2.5 标准曲线的制备

分别精密吸取“2.4”项下标准溶液 2 m L于100 m L量瓶中，加水稀释定容至刻度，分别精密吸取 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0 m L于 100 m L量瓶中，用水定容至刻度，分别吸取 10μL注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行分析测定，以峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标，拟合回归标准曲线，结果见表1。试验结果表明，8种着色剂在0.050～ 1.037μg/m L范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

精密吸取“2.4”项下标准溶液 10μL进入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件重复测定5次，分别以柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝面积计算RSD分别为0.96%，0.45%，0.40%，0.37%，0.59%，2.48%，1.20%，0.42%。结果表明精密度良好。

表1 标准曲线方程和回收率试验结果

2.7 稳定性试验

分别在0，2，4，12，24，48，72 h精密吸取“2.4”项下标准溶液10μL注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，分别以柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝面积计算RSD分别为1.03%，0.75%，0.64%，0.71%，0.78%，2.78%，1.56%，0.72%。结果表明稳定性良好。

2.8 检出限试验

精密吸取“2.4”项下标准溶液 0.05μL于100 m L量瓶内，加水定容至刻度，摇匀，精密吸取10μL注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，计算当信噪比为3时，检出浓度为检出限。柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝的检出限分别为 0.12，0.12，0.21，0.06，0.15，0.85，0.94，0.14 ng，本方法的最低检出浓度分别为0.012，0.024，0.042，0.012，0.030，0.085，0.094，0.014 mg/kg。

2.9 加标回收试验

精密吸取“2.4”项下混合标准溶液 60μL加入到阴性样品漂洗液中，按供试品溶液制备方法，平行制备3份，按“2.1”项下色谱条件测定，计算加标回收率，见表1。结果表明，本方法回收率在94.09% ～ 100.34%之间，能满足分析要求的准确性。

2.10 样品测定

分别取5种保健食品维生素片，按“2.4”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算样品中8种合成着色剂的含量，结果见表2。

表2 样品测定结果

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的选择

通过二极管阵列检测器全波长扫描，8种合成着色剂在不同的波长下,吸收强度大小不同，综合各种波长下相应结果，在254 nm波长处8种合成着色剂均有较好的响应值，故选择254 nm作为检测波长。由文献[1-6]可知甲醇-乙酸铵为测定合成着色剂常用流动相，通过改变甲醇-乙酸铵的比例来实现8种合成着色剂的分离度符合要求，最后选择甲醇-0.02mol/L乙酸铵梯度洗脱，新红保留时间为10.185m in，柠檬黄保留时间为11.352 min，苋菜红保留时间为12.388 m in，靛蓝保留时间为14.035 m in，胭脂红保留时间为19.767 m in，日落黄保留时间为24.442m in，亮蓝保留时间为27.015min，赤藓红保留时间为29.758 m in。各成分的分离度均大于1.5，符合分析要求。

3.2 提取方法的选择

通过比较直接用水浸泡和粉碎后用水洗涤，发现粉碎后用水洗涤提取比较完全，因此选择将维生素片粉碎后直接用水洗涤。为减少杂质对目标成分的干扰，参考有关文献，选择用聚酰胺吸附色素，用甲醇-甲酸混合溶液除去天然色素干扰，再用乙醇-氨水-水混合溶液解吸目标成分。

3.3 合成着色剂对人体的危害

合成着色剂采用人工化学合成的方法，主要通过从煤焦油中分离得到的苯胺燃料等作为原料，通过一系列化学反应生成具有各种颜色的化学物质，其中大多是偶氮类型化合物，多数偶氮类化合物可以在人体内代谢生成具有毒副作用的物质，过量食用将对人体健康造成一定危害。因此国家对合成着色剂的添加和食用制定了严格的标准，从安全角度来说，只要在国家标准许可范围内，就不会对健康造成危害，然而经常食用添加着色剂的保健食品维生素片也会造成合成着色剂摄入过量。因此，广大消费者在购买和使用保健食品维生素片时一定要注意其中是否添加合成着色剂，尽量选择没有添加合成着色剂的产品，从而减少合成着色剂的摄入。

3.4 结论

本文建立了RP-HPLC同时测定保健食品维生素片中8种合成着色剂的含量，该方法精密度、稳定性良好，检出限低，重现性好，能够较好地应用于维生素片中合成着色剂的测定，为维生素片的市场监管和质量控制提供了一定的技术支持，同时提醒消费者对合成着色剂的关注。

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Simultaneous Determ ination of 8 Edible Synthetic Colorants in Vitam in Tablets by RP-HPLC

Wang M ingzhi，Wang Yingyu，Chen Rong，Zhang Chao，Zhang Huafeng，Gu Bingren（Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215104，China）

Objective:To establish a method for simultaneous determ ination of 8 synthetic colorants in vitam in tablets by RP-HPLC.Methods:Chromatographic column C18（250 mm ×4.6 mm，7μm）was used and the mobile phase wasmethanol-0.02 mol/L ammonium acetate with gradient elution.The detection wavelength was at 254 nm.Results:There was a good linearity between the peak area and concentrations of 8 synthetic colorants w ithin the range of 0.050～1.037μg/m L（r＞ 0.999）,and the average recoveries were 94.09%～100.34%.Conclusion:The method is stable,sensitive,convenient and fast,and can be used as a method for the determ ination of synthetic colorants in vitam in tablets.

RP-HPLC；Edible Synthetic Colorant；Vitam in Tablet；Content

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.07.003

2015-03-10）

汪明志，男，中药师。研究方向：药品质量标准研究。E-mail：2279792632@qq.com