布鲁菌赤藓醇代谢研究概况

景志刚, 董 浩, 刘冠慧

(1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032； 2. 中国动物疫病预防控制中心，北京 102600；3. 河北工程大学，河北邯郸 056038)

布鲁菌赤藓醇代谢研究概况

景志刚1, 董 浩2, 刘冠慧3*

(1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032； 2. 中国动物疫病预防控制中心，北京 102600；3. 河北工程大学，河北邯郸 056038)

布鲁菌感染动物后可以逃避宿主免疫系统清除而长期存在，并严重侵害动物生殖系统。赤藓醇是布鲁菌的一种优势碳源，对布鲁菌的生长具有明显促进作用。在布鲁菌基因组中已经鉴定出6个与赤藓醇代谢相关的基因，布鲁菌的赤藓醇代谢途径也基本研究清楚。缺失布鲁菌赤藓醇代谢相关基因会造成布鲁菌在多种感染模型中的生存能力不同程度的改变。论文从布鲁菌对赤藓醇的亲嗜性、赤藓醇代谢通路及转运、赤藓醇代谢的基因调控、赤藓醇对布鲁菌毒力影响等方面进行了综述。

布鲁菌，赤藓醇，代谢，毒力

布鲁菌(Brucella)为革兰阴性胞内寄生菌，动物感染布鲁菌后的临床特征是生殖系统受到严重侵害，雌性动物表现为流产、不孕等，雄性动物出现睾丸炎、附睾炎等。布鲁菌在含赤藓醇丰富的胎盘滋养层中快速增殖引起胎盘病变是布鲁菌病(简称布病)导致流产的原因[1]。赤藓醇结构和化学性质类似于其他多元醇，但是布鲁菌更偏好利用赤藓醇作为碳源。鉴于布鲁菌的赤藓醇代谢可能与感染家畜流产密切关联，研究者对布鲁菌赤藓醇代谢的生化过程、转运和基因调控等方面进行研究，同时也进行了赤藓醇代谢对布鲁菌毒力影响的研究。

1 布鲁菌对赤藓醇的亲嗜性

Smith H等[2]首次从流产胎儿绒毛叶中纯化到促进布鲁菌生长的活性因子并鉴定为赤藓醇，大量试验数据也表明赤藓醇在一定条件下对布鲁菌生长有明显的促进作用。赤藓醇(又名赤藓糖醇)是一种四元醇，生产上多利用酵母发酵葡萄糖大量生产以用作甜味剂等[3]，广泛存在于动植物体内，但在反刍动物胎儿组织中含量极其丰富。研究表明羊胎血液中赤藓醇含量可高出母体血液60倍，牛胎组织中赤藓醇含量也明显高于孕牛胎盘及其他组织[4]。对感染布鲁菌的怀孕母畜进行病理学检测和细菌学检测的结果均表明布鲁菌在感染动物内的定殖具有明显的组织偏好性，胎儿绒毛叶、绒毛膜等赤藓醇含量高的组织是病变最严重的组织，也是含菌量最高的组织。

怀孕母畜除胎盘外，其他组织和外周血中赤藓醇含量很低(<2 μg/mL)，而胎儿组织中赤藓醇含量明显高于母畜，尿囊液、绒毛叶等组织赤藓醇含量是母畜胎盘的3倍～5倍(约150 μg/mL)。感染布鲁菌后易发生急性胎盘炎的母畜，如山羊、绵羊、牛、猪等胎盘组织赤藓醇含量较高(22 μg/mL～60 μg/mL)，而人、兔、豚鼠和大鼠等不易发生急性胎盘炎的动物胎盘组织赤藓醇含量则很低(<2 μg/mL)[4]。雄性动物生殖器官含有较高浓度的赤藓醇，可能是布鲁菌在雄性动物睾丸内局限性增殖的原因。此外，高浓度赤藓醇的存在对细菌利用其他碳源有一定抑制作用[5]。布鲁菌优先利用赤藓醇作为碳源或能量来源的特性与其在感染动物生殖系统内的偏好性定殖及毒力密切相关。

2 布鲁菌赤藓醇代谢

2.1 调控赤藓醇代谢相关的基因

由于赤藓醇与布鲁菌毒力密切相关，因此赤藓醇代谢基因及其编码产物和赤藓醇代谢中的功能在布鲁菌中研究最为清楚，目前已经鉴定出多个参与赤藓醇代谢的相关基因。Sangari F J等[6]构建了B.abortus2308转座子突变文库，成功筛选到生长被赤藓醇抑制的突变株，通过对转座子Tn5插入位点两侧区域进行了克隆和序列分析证实由4个基因eryABCD组成的ery操纵子对于布鲁菌赤藓醇代谢是必需的。这4个基因被短的基因间隔区分开，在eryA上游含有一个启动子，eryD下游含有一个假定转录终止子。ery操纵子的转录被eryD所编码的eryD转录调控因子抑制，而赤藓醇与eryD结合后可改变原eryD-启动子DNA区域结合构象并激活ery操纵子[6]。eryA、eryB和eryC分别编码赤藓糖醇激酶、L-赤藓醇-4-磷酸脱氢酶、酮丁糖-4-磷酸脱氢酶，最终将赤藓醇转化为D-3-酮丁糖-4-磷酸。Barbiera T等[7]鉴定出ery操纵子下游2个新的参与布鲁菌赤藓醇代谢编码基因，分别命名为eryH和eryI，相应的编码产物催化赤藓醇代谢中的中间产物D-3-酮丁糖-4-磷酸经D-赤藓酮糖-4-磷酸转化为D-赤藓糖-4-磷酸。通过对这些调控基因进行突变，可以影响赤藓醇的合成和代谢等[8]。

通过与苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)、豆科根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)中参与赤藓醇代谢基因所在的保守性区域进行比对，以及比对经验证的赤藓醇代谢基因发现了布鲁菌中另外一些可能参与赤藓醇代谢的基因，但尚未经试验验证。对S19全基因组测序并与B.abortus2308 和R.leguminosarum3841中参与赤藓醇摄入和利用的ABC转运操纵子(eryEFG)进行比对发现，B.abortus2308的编码基因BAB2-0376与R.leguminosarum3841中的编码基因eryF(其编码产物对于赤藓醇摄入是必需的)具有85%的序列同源性，因此作者推测在布鲁菌中该基因编码产物同样参与赤藓醇代谢[9]。Geddes B A等[10]将eryH基因上游有一个编码假定调节蛋白DeoR的基因命名为eryR，通过与DeoR家族其他成员进行比对，推测编码蛋白eryR可结合赤藓醇代谢通路中的中间产物(很可能为磷酸酯)并与EryD一起调控参与赤藓醇代谢酶类的表达。

2.2 赤藓醇转运和代谢途径

根据对其他糖类小分子胞内转运的研究，通过扩散作用经磷脂双分子层到达胞内这一方式不能转运足量的赤藓醇，因此研究者预测可能有特殊的转运系统将赤藓醇转运至布鲁菌胞内[11]。大肠埃希菌中的甘油易化蛋白(glycerol facilitator，GlpF)属于主嵌入蛋白(major intrinsic protein,MIP)家族，该蛋白可以在细胞质膜形成一个通道，胞内外存在的浓度差使甘油或赤藓醇等渗透向胞内[12]。对赤藓醇敏感的布鲁菌在含有甘油的培养基中生长也不利，因此推测赤藓醇也是被GlpF相似蛋白转运布鲁菌中[6]。布鲁菌中也存在MIP家族成员，即AqpX基因所编码的一个水通道蛋白，但试验结果表明该基因突变后并不影响赤藓醇转运。苜蓿中华根瘤菌中ABC-转运系统对赤藓醇转运至胞内是必需的，del Vecchio等对B.melitensis16M基因组进行生物信息学分析后预测BMEI1579-1581基因编码的一个假定多元醇ABC-转运系统可将赤藓醇转运至布鲁菌内，但是突变该转运系统并不影响赤藓醇转运。赤藓醇是如何转运至布鲁菌中这一过程仍有待研究。

1975年，Sperry和 Robertson利用放射性标记技术初步解析了布鲁菌中的赤藓醇代谢通路，近年来对布鲁菌中赤藓醇的代谢通路又取得了重要进展。研究表明,赤藓醇先被赤藓醇激酶(eryA基因编码)催化发生磷酸化反应(ATP参与)生成L-赤藓醇-4-磷酸，然后被eryB基因编码的脱氢酶氧化为L-3-酮丁糖-4-磷酸，随后在NAD-依赖性脱氢酶作用下发生醛基化反应，反应产物D-3-酮丁糖-4-磷酸在一系列酶催化下生成D-赤藓糖-4-磷酸。D-赤藓糖-4-磷酸在磷酸戊糖途径相关酶参与下经过脱氢反应和脱羧反应等生成甘油醛-3-磷酸和果糖-6-磷酸，最后作为糖酵解和糖异生等途径的中间产物参与糖代谢过程[7]。

3 赤藓醇代谢与布鲁菌毒力

赤藓醇对细菌及宿主细胞均不存在致突变作用[13]，但通过影响细菌菌膜代谢等过程可能影响细菌毒力[14]。评价赤藓醇代谢与布鲁菌毒力间的相互关联可以使用标准菌株和分离到的野毒株，也可以使用筛选到的突变株，如S19菌株在培养过程中常会出现生长不被赤藓醇抑制但无法氧化赤藓醇的突变株。此外，利用分子生物学技术缺失或者突变布鲁菌基因组中参与赤藓醇代谢的相关基因所构建的突变株可以用来评价赤藓醇代谢对布鲁菌的毒力影响。在实验动物的选择上，使用反刍动物评价赤藓醇代谢与布鲁菌毒力的研究很少，使用细胞、小鼠和豚鼠等不同模型进行大量关于赤藓醇代谢与布鲁菌毒力的研究，得到的结果存在很大差异。

3.1 布鲁菌S19疫苗菌株的赤藓醇代谢

S19疫苗菌株是世界上预防奶牛布鲁菌最有效、使用最广泛的疫苗，该菌株是1923年Dr. John Buck从奶样中分离到的一株牛源布鲁菌自然突变形成的弱毒株。早期不同国家和地区使用的S19菌株在含赤藓醇培养基中的生长及对赤藓醇的利用率存在很大差异，1956年美国农业部开始使用筛选到的对赤藓醇敏感菌株取代最初使用的菌株[15]。对赤藓醇敏感的S19疫苗安全性更高，说明赤藓醇代谢与布鲁菌毒力之间可能存在联系，一些研究认为动物布鲁菌疫苗导致怀孕奶牛流产有可能是疫苗中存在的赤藓醇耐受株造成的[16]。S19国际标准菌株、欧盟S19标准菌株以及许多国家广泛使用的S19疫苗菌株均对赤藓醇敏感，与早期研究一致，菌株在培养过程中均会出现赤藓醇耐受突变株(突变率1.3×10-7～1.4×10-2)，因此不能仅根据赤藓醇利用情况区分S19疫苗菌株和牛种Ⅰ型布鲁菌野毒株。

对于S19疫苗株无法利用赤藓醇的原因，研究者们进行了一系列的研究。有研究表明在对数期生长的S19菌株培养基中加入赤藓醇30 min后，ATP含量可降低10倍，推测赤藓醇激酶造成的ATP含量急剧消耗以及有毒产物的积累可能是导致赤藓醇抑制S19菌株生长的原因。通过对S19菌株ery操纵子进行序列分析发现，eryC基因3′端和eryD基因5′端之间有一段702 bp的缺失，导致编码产物变为eryC-D融合多肽。利用同源重组技术将该段序列整合至S19菌株形成的互补菌株对赤藓醇不敏感并且可以氧化赤藓醇，但是对小鼠的毒力同S19菌株相一致。此外，印度等一些国家使用的商业性S19疫苗菌株虽然未发现这段序列的缺失，但是仍对赤藓醇敏感，因此该段序列对布鲁菌是否对赤藓醇敏感或者对小鼠毒力是否致弱可能并没有相关性[16]。以上研究结果说明S19菌株毒力致弱并不完全是由ery基因缺失引起的，也可能与染色体其他位置的突变有关。

3.2 赤藓醇代谢对布鲁菌胞内增殖的影响

在多种不同细胞模型上的一些试验结果表明，布鲁菌缺失赤藓醇代谢所必需基因后在细胞内的增殖明显低于亲本菌株。B.abortus2308 缺失ery启动子后在RAW 264.7细胞系的胞内增殖情况与亲本菌株相比Log值降低3.78[17]；B.suis1330的eryC突变株在J774A.1、THP-1和BMM等不同细胞系内的增殖情况均显著低于亲本菌株[18]。虽然赤藓醇对布鲁菌的生长有一定的促进作用，但布鲁菌感染细胞后的细胞培养液中添加赤藓醇对胞内布鲁菌的增殖并没有促进作用[19]。

3.3 赤藓醇代谢对布鲁菌感染小鼠毒力的影响

用不同动物模型评价赤藓醇代谢对布鲁菌毒力影响取得的结果存在矛盾。一些研究表明利用赤藓醇与布鲁菌毒力无直接联系。Margaret证实不同赤藓醇利用率的布鲁菌对豚鼠的致病力无明显差异；Sangari F J 等[20]认为布鲁菌对小鼠毒力与赤藓醇代谢无关，主要基于两个试验结果,构建B.abortus2308转座子突变文库筛选到的赤藓醇敏感突变株对小鼠的毒力与B.abortus2308一致；S19菌株自发突变产生的赤藓醇不敏感株以及ery缺失区域互补菌株对小鼠的毒力与S19一致。但一些研究表明布鲁菌赤藓醇代谢对其致病力有影响，如B.suis1330eryC基因缺失株对小鼠毒力明显低于亲本菌株及其互补菌株，脾脏载菌量在感染早期差异最为显著[18]；B.abortus2308菌株缺失ery操纵子启动子区域获得的突变株对小鼠的致病力较B.abortus2308菌株和S19菌株明显减弱，在感染10周后即被完全清除，而且引起的脾脏炎症也最为轻微[17]。

从上述研究可以看出，小鼠或豚鼠可能并不适于评价赤藓醇代谢对布鲁菌毒力的影响，因为啮齿动物赤藓醇含量明显低于反刍动物，而且不是布鲁菌的自然宿主。布鲁菌对不同动物的毒力与细菌菌株、剂量、接种途径有关，并且与动物遗传背景、年龄、性别和生理学状态等许多因素有关。因此，以小鼠或豚鼠为动物模型评价布鲁菌毒力时，得到的试验结果可能与从反刍动物得到的试验结果不一致，如布鲁菌铁载体(2,3-dihydroxybenzoic acid，2,3-DHBA)编码基因缺失后对小鼠毒力无影响，但对孕牛的毒力明显降低[21]。除此之外，由于豚鼠和小鼠对布鲁菌的敏感性不同，因此使用小鼠和豚鼠为模型也可能得到不一致的试验结果，如豚鼠感染布鲁菌后注射赤藓醇，感染严重程度明显增加，而小鼠感染布鲁菌后注射赤藓醇对脾脏载菌量无影响[22]。使用含赤藓醇的人工基底膜构建的小鼠模型用于布鲁菌导致流产的研究可以观察到布鲁菌会在含赤藓醇的区域进行偏向性定殖，因此作者认为可以使用该模型进行布鲁菌赤藓醇代谢研究。

4 小结

赤藓醇是诱导布鲁菌感染动物胎盘组织和胎儿的重要原因，目前对布鲁菌中赤藓醇代谢的生化过程和代谢相关基因进行了较多研究，但赤藓醇如何转运进入布鲁菌、是否存在其他与赤藓醇代谢相关基因以及布鲁菌赤藓醇相关基因与其对反刍动物致病性的关系等问题仍需进一步研究。鉴于布鲁菌对赤藓醇的利用与怀孕反刍动物的流产密切相关，对布鲁菌中赤藓醇代谢相关研究对探索布鲁菌致病机制及寻找相关的治疗靶点具有重要意义。

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Introduction toBrucellaErythritol Metabolism

JING Zhi-gang1, DONG Hao2, LIU Guan-hui3

(1.LaboratoryofZoonoses,ChinaAnimalHealth&EpidemiologyCenter,Qingdao，Shandong,266032,China; 2.ChinaAnimalDiseaseControlCenter,Beijing,102600,China, 3.HebeiUniversityofEngineering,Handan,Hebei,056038,China)

Brucellaexploit multifarious strategies to establish long-lasting infection in host and cause severe damage to infected animals. Erythritol is a powerful growth stimulant ofBrucellaand is used in preference to other carbon sources. Six genes have been experimentally confirmed to be involved in gene regulation of erythritol metabolism, and catabolism pathways of erythritol have been basically elucidated. Mutants with an inactive ery operon showed different degrees of change in survival ability compared with wild typeBrucellastrain in a variety of infection models. Priority use of erythritol inBrucella, transport and catabolism pathways of erythritol, relevance between the ability of utilization erythritol and the pathogenicity ofBrucella, genes involved in erythritol metabolism regulation were summarized in this article for further understanding of role of erythritol inBrucellapathogenic mechanism.

Brucella；erythritol；metabolism；virulence

2016-05-04

河北省高等学校科学技术研究项目(QN2016170)

景志刚(1989-)，男，山西沁水人，硕士，主要从事人兽共患病研究。 *通讯作者

S852.614

A

1007-5038(2016)12-0109-04