发酵产赤藓糖醇研究进展

王建彬，郭传庄，王松江，隋松森，李俊霖

诸城东晓生物科技有限公司（诸城 262200）

赤藓糖醇（Erythritol），又名原藻醇，它属于多元醇类甜味剂，在自然界中广泛存在，在动物、植物、微生物中均有发现，如在真菌类微生物、水果、各类发酵食品、动物组织及体液等中均发现有少量赤藓糖醇存在。1999年赤藓糖醇被国际食品添加剂委员会批准作为食品甜味剂，是一种纯天然的绿色保健食品[1]。2003年欧盟食品科技委员会（SCF）认为，赤藓糖醇用于食品是安全的，并于2016年批准赤藓糖醇作为风味增强剂用于低能或无添加糖调味饮料。同年，加拿大卫生部发布通报，批准赤藓糖醇作为甜味剂用于部分碳酸饮料。根据欧盟REG.（EU）673/2016，赤藓糖醇可作为食品添加剂用于有机食品中[2]。近年来，随着对赤藓糖醇研究逐步深入，其作为一种纯天然的、健康的添加剂被越来越多的消费者所接受，其应用领域也更加广阔。

1 赤藓糖醇的性质

赤藓糖醇是由葡萄糖经发酵而得到的一种白色晶体，其甜度是蔗糖甜度的70%～80%，甜味纯正，无后苦味[3]。它在溶解过程中吸收热量，有类似于麦芽糖醇的清凉感，适宜作甜味剂。赤藓糖醇结晶性好，几乎不吸潮，甚至在20 ℃、相对湿度90%情况下仍不吸潮[4]。赤藓糖醇耐热性强，在普通的烘焙过程中，不会受热分解和发生褐变。赤藓糖醇耐酸性较强，酸性条件下不会分解[5]。相较于其他糖类，赤藓糖醇不能被细菌发酵利用，而且可以抑制部分微生物生长，因此，赤藓糖醇具有食品防腐剂和甜味剂的双重功效。另外，人体消化系统中没有分解赤藓糖醇的酶，超过90%的赤藓糖醇直接通过尿液排出体外，并不经过人体代谢且不会改变血糖浓度和胰岛素水平，所以，糖尿病患者食用该糖醇不会影响健康。经试验表明，赤藓糖醇对多种口腔链球菌具有抑制作用，其抑制效果优于木糖醇。此外，因赤藓糖醇具有保湿和改善皮肤粗糙的效果，如日本资生堂研制配有赤藓糖醇的护肤用品，以取代化妆品中甘油的添加[6-7]。在化工行业，赤藓糖醇逐渐被广泛应用于合成多种功能化合物，如表面活性剂、树脂材料[8]。近年来。随着相变材料受到越来越多的关注，赤藓糖醇作为热能存储的相变材料，被广泛应用于废热回收利用、太阳灶、吸收式制冷机、汽车冷却液废热回收系统等[9-12]。

2 赤藓糖醇生产工艺

赤藓糖醇的生产以淀粉为原料有2条工艺途径，即化学法和发酵法。化学法是将淀粉用高碘酸法生成双醛淀粉，经氢化裂解生成赤藓糖醇和其他衍生物。因为化学法的工艺流程长，生产成本高，对环境影响大，化学法逐渐被发酵法取代。发酵法将淀粉以酶法进行液化、糖化生成葡萄糖，采用耐高渗酵母或细菌进行微生物发酵，使葡萄糖转化成赤藓糖醇。其具体生产流程：淀粉→液化→糖化→葡萄糖→生产菌株发酵→过滤→色层分离→净化→浓缩→结晶→分离→干燥，得到赤藓糖醇。国内赤藓糖醇生产企业多以发酵法为主。

赤藓糖醇的生产菌株多为酵母，少部分为霉菌和细菌。从菌种的生产能力及产物情况来看，耐高渗酵母是最为适宜的赤藓糖醇生产菌株。能生产赤藓糖醇的菌种有假丝酵母属（Candida）、球拟酵母属（Torulopsis）、从梗孢酵母属（Moniliella）、三角酵母属（Trigonopsis）、接合酵母属（Zygosaccharomyces）、毕赤酵母属（Pichia）、汉森氏酵母属（Hansenula）等属。

中国对于赤藓糖醇发酵的研究虽起步较晚，但近年来取得成效。范光先等[13]发现球状酵母OS-194可用于赤藓糖醇的发酵；吴燕等[14]通过20%初始葡萄糖通加补料发酵法，使赤藓糖醇含量达到162.5 g/L；裴疆森等[15]通过定向诱变筛选出一株解酯假丝酵母使用35%浓度葡萄糖发酵，赤藓糖醇转化率达52%以上。

3 与赤藓糖醇相关的研究方向

近年来，随着赤藓糖醇在食品、医药和化工等领域得到应用，其全球需求量逐年攀升。但是较低的生产总量无法满足日益增长的需求，赤藓糖醇市场面临着巨大供需缺口。所以，对赤藓糖醇产业的大力发展和深入研究显得尤为重要。

3.1 菌种的选育和诱变

对于赤藓糖醇发酵的优化策略主要是以诱变筛选耐高渗酵母为主。自然界中的高糖环境为筛选耐高渗野生菌株提供条件，如蜂蜜和花粉。同时，自然突变及人工诱变也是筛选产赤藓糖醇优良突变菌株的主要来源。对于高产赤藓糖醇菌株的获取主要是人工诱变。通过人工诱变的方式能够提高菌株突变率。Ishizuka等[16]通过紫外线和亚硝基胍（NTG）处理筛选得到的赤藓糖醇高产菌Aureobasidiumsp.SN124A，对葡萄糖转化率达到47.6%。Yang等[17]报道高渗酵母C.magnoliae的突变株生产赤藓糖醇的浓度比野生菌株提高25%，生产速率提高30%。还有一株Penicilliumsp.KJ81菌株经UV诱变处理后，筛选的菌株不仅其赤藓糖醇的产量大幅增加，且同时降低副产物甘油的生成以及发酵过程中泡沫的产生[18]。

随着诱变技术的发展，多种诱变方式的组合进一步提高诱变育种效率。一些新的诱变技术的广泛应用为高效诱变育种提供可能。如常压室温等离子体（ARTP）诱变技术，因其易操作，突变率高，安全无毒的特点被越来越多的企业使用。杨利博[19]报道称，通过ARTP和硫酸二乙酯（DES）复合诱变，获得的菌株Y-07，其赤藓糖醇产量、得率分别比初发菌株提高217.5%，71.4%，且遗传形状稳定。

另外，近年来基因工程技术的迅猛发展，为获得优良的赤藓糖醇发酵菌株提供新方式。有报道称，可采用分子生物技术手段阻断或降低副产物产生途径，从而使目标产物的产量及纯度提高。高慧[20]利用Cre-Loxp系统敲除Torulasp.菌株的3-磷酸甘油脱氢酶基因，并将得到的2株菌株进行杂交融合，经优化发酵工艺，最终赤藓糖醇产量达到253 g/L，且副产物甘油浓度大幅降低。

3.2 菌种的驯化和培养基优化

工业生产上以追求“低投入，高产出”为工艺路线的设计原则。菌种的遗传稳定性和经济化的培养方式，是发酵行业最注重的环节。每一株选育出的菌种，尤其是诱变筛选后的菌种均要经过遗传稳定性的检测。刘凤珠等通过紫外诱变试验获得一株耐高渗透压菌株，其生产赤藓糖醇浓度提高98%，并通过5代传代试验证明为稳定遗传[21]。

对于产赤藓糖醇的耐高渗酵母，高浓度的起始葡萄糖有利于赤藓糖醇的积累。Lee等[22]报道起始葡萄糖质量浓度为400 g/L时，球拟酵母仍然能够高效生产赤藓糖醇。但是过高的底物浓度会带来较高的渗透压，进而抑制酵母细胞的生长及代谢。因此，在以葡萄糖为底物的赤藓糖醇发酵过程中，通常以分批及补料分批的发酵方式，维持葡萄糖在较高浓度水平。Ryu等[23]报道通过分阶段控制菌体生长和赤藓糖醇生成可有效提高赤藓糖醇产量。另外，由于赤藓糖醇是还原性代谢产物，相关的氧化还原酶涉及到多种金属离子的辅助因子。所以，对于耐高渗酵母其他营养物质和微量元素进行调节同样能够起到提高赤藓糖醇产量的效果。如发酵过程中以植酸代替磷源能提高发酵速率[24]。在发酵培养基中添加对产赤藓糖醇关键酶起调节作用的金属离子，如Cu2+可促进赤藓糖醇还原酶的活性，进而提高赤藓糖醇产量[25]。

3.3 产赤藓糖醇代谢路径研究

提高微生物产赤藓糖醇的能力，必须要了解其代谢路径。通常情况下，真菌通过磷酸戊糖途径（PPP）合成赤藓糖醇，转酮酶是磷酸戊糖途径中的关键酶，需要高活性的转酮酶来生成大量的中间产物，进而合成赤藓糖醇。以酵母菌为例，酵母菌摄入的葡萄糖首先转化为6-磷酸葡萄糖，经过磷酸戊糖途径生成4-磷酸赤藓糖，在 4-磷酸赤藓糖激酶的作用下去磷酸化，生成赤藓糖，赤藓糖在赤藓糖还原酶的作用下生成赤藓糖醇。有报道称优良的酵母基因突变株，以葡萄糖为底物，经发酵后赤藓糖醇得率达40%[26]。

细菌中能够合成赤藓糖醇的主要为乳酸菌。其代谢途径与酵母菌有所区别。细菌中葡萄糖经过糖酵解生成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖在磷酸葡萄糖异构酶的作用下异构化生成6-磷酸果糖，在磷酸转酮酶作用下6-磷酸果糖裂解成乙酰磷酸和4-磷酸赤藓糖，4-磷酸赤藓糖在4-磷酸赤藓糖脱氢酶作用下生成4-磷酸赤藓糖醇，4-磷酸赤藓糖醇在去磷酸酶作用下生成赤藓糖醇。由于赤藓糖醇发酵过程中底物浓度较高，而细菌的环境胁迫耐受能力又弱。所以，赤藓糖醇发酵生产多以耐高渗酵母为主要发酵菌株。

图1 微生物产赤藓糖醇代谢路径

3.4 关键酶-赤藓糖醇还原酶的研究

根据微生物的赤藓糖醇代谢途径，能够分析出其生产过程中的关键酶，进而通过研究该酶的特性进一步提高赤藓糖醇产量。如研究关键酶的最佳反应参数、分子构型等，通过对关键酶进行克隆和表达，使关键酶得到积累；通过分析确定该酶反馈调节作用位点，并进行定点突变，调高酶活，进而提高目标产物的积累。赤藓糖还原酶是耐高渗酵母菌产赤藓糖醇的关键酶。对赤藓糖还原酶进行较多研究，为通过酶蛋白工程和基因工程技术改良赤藓糖醇的生产奠定基础。Lee等[22]对一种来源于Torula corallina的NADPH依赖型赤藓糖还原酶进行研究，发现其最佳反应pH 6.0，最佳反应温度40 ℃，并发现该酶不产生其他产物，专一性高，为该菌种产赤藓糖醇较多提出解释。Park等[27]发现Candida magnoliae中的赤藓糖还原酶的表达受来自于高浓度的糖，KCl和NaCl所造成的高渗透压影响，较高的渗透压能够促进该酶的表达。Lee等[28]对一株新分离菌株Candida magnoliaeJH110的赤藓糖醇还原酶进行克隆，获得该酶的基因序列，并以大肠杆菌为宿主菌进行克隆表达，经试验发现该酶最适pH 5.5，最适温度42 ℃，并证明该酶可使其他非产赤藓糖醇的微生物具备生产赤藓糖醇的能力。

4 展望

赤藓糖醇作为一种理想的多功能的健康甜味剂，适宜于糖尿病患者，能抑制口腔细菌生长，其应用领域越来越广泛。微生物发酵法替代化学法，其优越性也愈加明显。对于提高微生物产赤藓糖醇产率，主要是筛选耐高渗酵母和诱变育种新菌株，这2种方法虽然简单易行，但也具有盲目性。现在的生物技术，尤其是微生物酶技术和基因工程技术的快速发展，为高效生产赤藓糖醇开辟了新道路。如研究微生物产赤藓糖醇关键酶的提取与使用条件，使其在菌外进行赤藓糖醇的直接转化；通过定点突变与基因敲除对关键酶进行改造等一系列方式提升酶活进而提高赤藓糖醇的产量；对影响代谢的关键因子进行敲除或调控，改变代谢途径，将代谢通路引流到合成赤藓糖醇的方向，进而减少副产物的生成，提高赤藓糖醇产量。