重组大肠杆菌全细胞合成苯基乳酸的研究

胡发根,沈 丽,吉华兰,罗 林,王立梅,齐 斌,朱益波,*

(1.苏州大学 基础医学与生物科学学院,江苏苏州 215000;2.常熟理工学院 苏州市食品生物技术重点实验室 发酵工程技术研究中心,江苏常熟 215500)



重组大肠杆菌全细胞合成苯基乳酸的研究

胡发根1,2,沈 丽2,吉华兰2,罗 林2,王立梅2,齐 斌2,朱益波2,*

(1.苏州大学 基础医学与生物科学学院,江苏苏州 215000;2.常熟理工学院 苏州市食品生物技术重点实验室 发酵工程技术研究中心,江苏常熟 215500)

在E.coliBL21(DE3)中过量表达D-乳酸脱氢酶基因(D-ldh),并优化该重组菌全细胞转化苯丙酮酸钠合成苯基乳酸的条件。通过单因素实验和正交实验优化诱导表达条件,并在此基础上对全细胞转化苯丙酮酸钠合成苯基乳酸进行了优化。结果表明,菌体OD600为1.2时添加IPTG至终浓度0.2mmol/L,25℃诱导4h后收集菌体具有最佳转化活性；最优分批转化条件:pH7.0,8.0g/L苯丙酮酸钠,20g/L葡萄糖,1%(v/v)吐温-80,菌体浓度20g/L(干重),37℃,转速200r/min转化0.5h,苯基乳酸产量和转化率分别达到4.91g/L,56%。在上述优化条件上通过流加苯丙酮酸钠和葡萄糖,经6h转化,苯基乳酸最终产量达到17.23g/L,转化率为54%。研究结果表明该重组大肠杆菌成功转化苯丙酮酸合成苯基乳酸,具有较好的应用前景,为系统化代谢工程改造大肠杆菌生物合成苯基乳酸的进一步研究和应用提供了有用的技术参数。

大肠杆菌,D-乳酸脱氢酶,苯基乳酸,全细胞生物转化

苯基乳酸(phenyllactic acid,PLA),也称3-苯基乳酸或2-羟基-3-苯基丙酸,是一种广泛存在于乳酸菌发酵产品和蜂蜜中的有机酸[1-3]。大量研究表明苯基乳酸可以有效抑制包括食源性致病细菌,如Listeriamonocytogenes、Enterococcusfaecalis、Staphylococcusaureus、Escherichiacoli、Providenciastuartii、Klebsiellaoxytoca,酵母和霉菌,如Aspergillusochraceus、Penicilliumroqueforti、Penicilliumcitrinu等多种微生物的生长[4-7]。此外,苯基乳酸在饲料添加剂[8-9]、医药[10]、化妆品等多方面都具有广泛的应用前景。这种由乳酸菌代谢产生的芳香族有机酸不仅对人和动物细胞均无毒性,还具有抑菌谱广,水溶性和热稳定性好,作用pH范围宽等特点,有望作为理想的食品防腐剂而获得研究人员的广泛关注[11]。

目前为止,用于苯基乳酸转化的微生物主要有真菌(Geotrichumcandidum)[12],乳酸菌(Lactobacillus,Enterococcus,Weissella,Leuconostoc),丙酸菌(PropionibacteriumjenseniiDSMZ 20535,P.thoeniiDSMZ 20276)[13]等,其中来自L.plantarumSK002[14],BacilluscoagulansSDM[15]的L-乳酸脱氢酶和来自P.acidilacticiDSM 20284,L.plantarumSK002[14],Lactobacillusconfusus[16],B.coagulansSDM[15]的D-乳酸脱氢酶,具有催化苯丙酮酸合成苯基乳酸的能力。但由于乳酸脱氢酶在微生物体内的表达受到严格调控而致使胞内乳酸脱氢酶含量较低,限制了苯基乳酸产量的提高。因此,利用基因工程技术获得高效表达乳酸脱氢酶的工程菌可能是提高苯基乳酸产量的有效途径。

本研究将来自L.plantarum的D-ldh克隆到大肠杆菌中过表达,以苯丙酮酸钠为底物,全细胞转化合成苯基乳酸。通过对基因表达条件和转化条件的优化,全细胞合成苯基乳酸,并取得较好结果,为系统化代谢工程改造大肠杆菌生物合成苯基乳酸的进一步研究和应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要试剂 D-3-苯基乳酸和苯丙酮酸标品 购自国药集团；酵母提取物,胰蛋白胨 购自Oxoid公司(英国)；DNA聚合酶,硫酸卡那霉素,氨苄青霉素和相关分子试剂盒 购自上海生工；限制性内切酶 购自大连宝生物公司(TaKaRa),所有实验试剂如果无特殊说明均为分析纯。

1.1.2 菌种和质粒Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum(CGMCC:1.2437) 购自中国菌种保藏中心(CGMCC)；pMD19-T Simple Vector 购自宝生物公司(大连)；E.coliDH5α,E.coliJM109,E.coli BL21(DE3),pET-28a(+)均为实验室保藏。

1.1.3 主要仪器 PCR扩增仪、水平电泳系统、垂直电泳系统、凝胶成像系统 美国Bio-RAD公司；高速台式离心机 德国Thermo公司；恒温金属浴 德国Eppendorf公司；高效液相色谱仪 日本岛津公司；恒温振荡培养箱 太仓市华美生化仪器厂。

1.2 重组菌株的构建与诱导条件优化

1.2.1 重组大肠杆菌的构建表达和功能验证 以植物乳杆菌基因组为模板,上游引物(P1:5′-CGCGGATCCATGAAAATTATTGCATATGC-3′)引入BamH I酶切位点,下游引物(P2:5′-CCCAAGC TTTTAATCAAACTTAACTTGTG-3′)引入Hind III酶切位点,PCR扩增得到长度为996bp的DNA片段,连接入克隆质粒pMD19-T Simple Vector并转化感受态E.coliJM109,筛选阳性克隆,经测序验证后由BamH I和Hind III双酶切,连接经相同酶切处理的线性表达质粒pET-28a(+),得到重组质粒命名为pET28a-D-ldh,将该重组质粒转化感受态E.coliBL21(DE3),重组子经菌落PCR验证后命名为E.coliBL21(DE3)/pET28a-D-ldh。

将活化的重组菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-D-ldh和空载体对照E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)按1%的接种量接种到装有100mL LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素)的摇瓶中,37℃、200r/min恒温振荡培养至OD600为0.6～0.8,加入1.0mmol/L诱导剂25℃诱导培养4h后,4℃、6000r/min离心10min,收集菌体用pH7.0磷酸钾缓冲液洗涤2次,重悬于10mL转化培养基中,反应1h后取样用高效液相色谱检测转化产物。同时取适量菌体SDS-PAGE分析乳酸脱氢酶表达情况。

1.2.2 乳酸脱氢酶诱导条件优化 采用单因素实验在摇瓶中考察诱导剂浓度,诱导温度,诱导时机和诱导时间对全细胞合成苯基乳酸的影响。重组大肠杆菌基础诱导条件:OD600为0.6时添加IPTG至0.6mmol/L,25℃诱导4h。根据单因素实验结果,设计4因素3水平的正交实验以优化诱导表达条件(表1)。

表1 正交实验因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal experimental design

1.3 全细胞转化条件的优化

在优化的诱导条件基础上,进一步优化全细胞转化条件。分别考察磷酸缓冲液pH、细胞干重、起始底物浓度、转化温度对转化苯丙酮酸合成苯基乳酸的影响。优化前基础转化条件:pH6.5,细胞干重10g/L,底物浓度9g/L,转化温度37℃。

1.4 摇瓶中流加转化

在最优的诱导条件和转化条件下,将菌体悬浮于50mL转化液,菌体干重20g/L,苯丙酮酸和葡萄糖起始浓度分别为8,20g/L。分别在0、0.5h添加0.4g苯丙酮酸钠,在1、1.5、2、4h添加0.2g的苯丙酮酸钠,定时取样。

1.5 高效液相色谱检测

苯丙酮酸钠、苯基乳酸和葡萄糖的检测:取一定量转化液于4℃、12000r/min离心20min,上清液稀释适当倍数,经0.22μm滤膜过滤后高效液相(岛津,LC-20A)检测。色谱条件:色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H有机酸分析柱；流动相为5mmol/L稀硫酸；流速0.6mL/min；柱温30℃；进样体积5μL,检测波长210nm。其中苯丙酮酸钠和苯基乳酸用紫外检测器检测,葡萄糖用RID-10A示差检测器检测。

2 结果与分析

2.1 重组大肠杆菌的构建与功能验证

用于本研究的Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum(CGMCC:1.2437)乳酸脱氢酶基因(D-ldh)编码332个氨基酸。E.coliBL21(DE3)/pET28a-D-ldh经1mmol/L IPTG、25℃诱导表达4h收集菌体进行SDS-PAGE分析。该重组菌在近41ku处有明显蛋白条带(图1,泳道2),相对分子质量和预期的大小一致,表明乳酸脱氢酶在大肠杆菌中表达成功。

图1 SDS-PAGE分析乳酸脱氢酶蛋白表达Fig.1 The analysis of D-lactate dehydrogenase protein by SDS-PAGE注:M:标准蛋白Marker;1:未诱导的重组菌;2:经诱导的重组菌;3:空质粒菌株;4:原始菌株。

重组大肠杆菌和对照菌全细胞转化见图2,重组大肠杆菌苯基乳酸产量达到5.01g/L,比未经过诱导的重组菌提高了4倍多。而值得注意的是原始菌株BL21(DE3)和含有空质粒的大肠杆菌也有一定的转化能力,分别达到0.71g/L和0.63g/L,可能是胞内也有一定水平乳酸脱氢酶或其它酶系对苯丙酮酸也有一定的转化能力。结果表明,在大肠杆菌中表达外源乳酸脱氢酶显著增强了全细胞的转化能力。

图2 不同菌株生物合成苯基乳酸的影响Fig.2 The bioconversion effect of native strains and recombinant strains

2.2 诱导条件优化

2.2.1 诱导剂浓度对合成苯基乳酸的影响 当IPTG浓度为0.2mmol/L时,苯基乳酸产量达到近2.7g/L(图3A)。此后随着诱导剂浓度的加大,苯基乳酸产量逐渐下降,值得注意的是菌体密度也发生了不同程度的下降,当诱导剂浓度为0.8mmol/L时,菌体密度相对0.2mmol/L诱导剂时降低了19%,说明诱导剂浓度过大,对重组菌的生长有抑制作用。

2.2.2 诱导温度对合成苯基乳酸的影响 当诱导温度为25℃时,苯基乳酸产量达到最大(图3B)。升高诱导温度,虽然菌体干重进一步提高,但是该重组菌的转化效率并没有随着菌体浓度的升高而升高,当诱导温度为35℃时苯基乳酸产量只有25℃的54%。这充分说明诱导温度对重组菌转化活性有显著影响。故采用25℃低温诱导有利于苯基乳酸的合成。

2.2.3 诱导时机对合成苯基乳酸的影响 合理的诱导时机不仅有利于乳酸脱氢酶大量表达,还有利于菌体的大量获得。起始诱导时机影响重组大肠杆菌合成苯基乳酸结果见图3C,当菌体诱导时机OD600为0.8时,苯基乳酸达到1.83g/L。

2.2.4 诱导时间对合成苯基乳酸的影响 诱导时间影响重组大肠杆菌合成苯基乳酸结果见图3D所示,随着诱导时间的增加,菌体浓度都有了一定程度的提高,但诱导时间超过6h后,苯基乳酸的产量开始下降。其原因可能是随着诱导时间的增加,全细胞转化活性开始下降。

图3 诱导条件的优化Fig.3 Optimization of induction condition注:A:诱导剂浓度对苯基乳酸生产的影响;B:诱导温度对苯基乳酸生产的影响;C:诱导时机对苯基乳酸生产的影响;D:诱导时间对苯基乳酸生产的影响。

2.2.5 正交优化 正交实验结果见表2。极差数据表明,相对于诱导剂浓度、诱导时机、诱导时间,诱导温度对苯基乳酸的合成影响最显著,而诱导时间对结果影响不大,故采用最佳的诱导条件组合为:诱导温度25℃、诱导剂浓度0.2mmol/L、诱导时间4h、诱导时机为菌体浓度OD600达到1.2时添加诱导剂,经实验验证后苯基乳酸产量达到5.0g/L。

表2 正交实验结果表Table2 Results of orthogonal experimentals

2.3 全细胞转化条件优化

在最佳的诱导条件下,考察了重组菌全细胞转化过程中影响苯基乳酸产量的因素。结果见图4,最优pH为7.0,最佳转化温度为37℃,最佳的底物浓度为8g/L,最佳的生物量为20g/L。同时对表面活性剂吐温-80在生物转化中对苯基乳酸合成影响的研究结果见图5,和对照组相比,在转化开始时向转化液中添加不同浓度的吐温-80,苯基乳酸产量均有不同程度的提升。当吐温-80达到1%(v/v)时,苯基乳酸产量达到4.91g/L,比对照组的3.8g/L提高了29%,转化率也达到了56%。这是因为吐温-80是一种非离子型表面活性剂,与细胞膜相互作用改变了细胞膜的通透性,有利于底物输入和产物输出。然而浓度过高可能会破坏细胞膜的完整性,对微生物有抑制或杀死作用[17]。

图4 生物转化条件的优化Fig.4 Optimization of bioconversion conditions注:A:pH对苯基乳酸生产的影响;B:转化温度对苯基乳酸生产的影响;C:底物浓度对苯基乳酸生产的影响;D:生物量对苯基乳酸生产的影响。

图5 吐温-80对转化合成苯基乳酸的影响Fig.5 Effect of Tween-80 on PLA production

2.4 底物流加强化苯基乳酸合成

通过分批添加底物可以有效避免转化过程中的底物抑制,有利于产物的合成。在反应的前1h,苯丙酮酸钠快速转化成苯基乳酸(图6)。随后,菌体转化活力逐渐下降,经6h转化和底物添加,最终苯基乳酸浓度为17.23g/L,生产率为2.87g/L/h,转化率达到54%。与乳酸菌Lactobacillussp. SK007,L.plantarumCRL 778,L.plantarum1081[13]相比,本研究获得的重组大肠杆菌全细胞转化反应体系简单,产物易于纯化,生产强度大,转化率高等特点。但另一方面,该工程菌有效转化时间短,从而限制了该重组菌的最终产物浓度以及底物转化率。来自植物乳杆菌的乳酸脱氢酶为NADH依赖型的脱氢酶[18],在转化苯丙酮酸的过程中,需要辅酶NADH的参与,该重组菌转化时间短的原因之一可能是由胞内缺乏辅因子所引起。Shuhuai Yu[18]报道将来自戊糖片球菌D-乳酸脱氢酶中加入甲酸脱氢酶进行双酶反应可以显著提高苯基乳酸产量。本研究首次将重组大肠杆菌全细胞运用于合成苯基乳酸的研究,与Wanmeng Mu[19-20]报道运用Lactobacillussp.SK007通过培养基优化和底物流加策略发酵生产苯基乳酸(17.38g/L)产量接近,比其转化率51.1%有所提高。但和Zhaojuan Zhan[15]报道用凝结芽孢杆菌(BacilluscoagulansSDM)全细胞生产苯基乳酸(产量37.3g/L,转化率70%)相比,产量和产率还有待进一步提高。本研究的优势主要体现在以下两个方面。第一,大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清晰,技术操作简单,培养条件简单,生长周期短等特点有利于对大肠杆菌进行代谢工程改造,如通过胞内辅因子再生提高苯基乳酸的产量。第二,全细胞转化反应需要培养大量的菌体,大肠杆菌高密度发酵技术已经比较成熟,为苯基乳酸工业化大规模生产提供了理论依据。

图6 底物流加培养生产苯基乳酸的时间曲线Fig.6 Time course of PLA production in fed-batch fermentation with intermittent PPA feeding

3 结论

目前,苯基乳酸的研究主要集中于高产菌种的筛选,不同来源微生物脱氢酶的研究和发酵策略的改善。本研究利用基因工程技术成功将Lactobacillusplantarumsubsp.Plantarum(CGMCC:1.2437)D-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中克隆表达,并将该重组大肠杆菌全细胞运用于苯基乳酸的合成。摇瓶转化结果表明,以苯丙酮酸钠为底物,在最优的诱导条件和转化条件下,苯基乳酸产量达到17.23g/L,转化率达到54%。Lactobacillussp.SK007[3,19]全细胞转化苯丙酮酸产量为1.12g/L,转化率达到56%,而通过培养基的优化苯基乳酸产量达到2.30g/L,转化率仅为46%。同国内外现有报道相比,本文苯基乳酸产量和转化率都达到了较高水平,为进一步代谢工程改造大肠杆菌生物合成苯基乳酸奠定了基础。

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Production of phenyllactic acid by using whole-cell recombinantEscherichiacoli

HU Fa-gen1,2，SHEN Li2，JI Hua-lan2，LUO Lin2，WANG Li-mei2，QI Bin2,ZHU Yi-bo2,*

(1.School of Biology and Basic Medical Sciences,Soochow University,Suzhou 215000,China;2.Research Center of Fermentation Engineering,Key Laboratory of Food and Biotechnology,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

D-lactate dehydrogenase was expressed in recombinantEscherichiacoliBL21(DE3),the expression conditions and bioconversion medium were optimized for the production of PLA with whole-cell transformation. Single factor experiments and orthogonal experiments were used to optimize induction conditions and the transformation conditions with the engineered whole-cells transformation. The optimized induction condition for D-ldhexpression was IPTG 0.2mmol/L and inducing for 4h at 25℃ and OD6001.2,the optimized batch reaction conditions in phosphate buffer(pH7.0)were:8g/L PPA,20g/L glucose,20g/L(dry cell weight),1% Tween-80,37℃,200r/min for 0.5h with PLA production of 4.91g/L and conversion ratio of 56%. Based on the above optimized conditions,fed-batch fermentation was conducted by intermittent feed PPA and glucose. After 6h transformation,the final PLA concentration reached 17.23g/L with the conversion ratio of 54%. Results showed that PPA was efficiently transformed into PLA through engineeredE.coliBL21(DE3)/pET28a-D-ldh. This study not only showed a good industrial application prospect,but also laid a foundation for metabolic engineering ofE.colifor the production of PLA.

Escherichiacoli;D-lactate dehydrogenase;phenyllactic acid;whole-cell bioconversion

2014-07-28

胡发根(1987-)，男，硕士研究生，研究方向：微生物学。

*通讯作者:朱益波(1980-)，男，博士，副教授，主要研究微生物转化和相关微生物改造。

科技部农业科技成果转化资金项目(2013GB2C100176);江苏省自然科学青年基金项目(BK20130380);江苏省高校自然科学研究项目(13KJB550002);江苏省“六大高峰人才”资助计划项目(NY-021)；苏州市科技支撑计划(SNG201354)；常熟市科技发展计划(CN201220)。

TS201.3

A

:1002-0306(2015)09-0147-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.024